CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 4 Acidi nucleici e nuovi farmaci

Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI FARMACI TRADIZIONALI DNA duplicato DNA RNA PROTEINA Duplicazione Trascrizione Maturazione Metabolismo Traduzione

VANTAGGI NELL’UTILIZZO DI FARMACI ANTI-ACIDI NUCLEICI A- BERSAGLIO MOLECOLARE PIU’ DEFINITO Numero di proteine intracellulari: 1000 -100000 Numero di RNA: 100 -10000 Numero di geni: 1 -2 B- SINTESI MIRATA Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma C- AZIONE MOLTO SPECIFICA Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i vantaggi della complementarità tra due catene secondo il modello di Watson e Crick

ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI 1. ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-RNA 2. ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA 3. RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA 4. APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una sequenza aminoacidica (competono con l’RNA nell’interazione tra RNA e proteina) 5. DECOY: DNA complementare a sequenze aminoacidiche (competono con sequenze di DNA nell’interazione DNA-proteina) 6. si. RNA: RNA complementari a sequenze specifiche

CRONOLOGIA DELL’ANTISENSO § 1957 Tripla elica in vitro (cell-free) § 1965 RNA antisenso in batteri § 1978 ODN antisenso § 1982 RNA catalitico (ribozima) § 1989 Recettore per ODN § 1990 Tripla elica in vivo (cellule) § 1990 Farmacotossicologia ODN in animali § 1993 Terapia dell’HBV nell’anatra § 1994 Sperimentazione ODN nell’uomo § 1998 FOMIVIRSEN è il primo ODN approvato per il trattamento della retinite da Citomegalovirus in pazienti con AIDS § oggi a. ODN di seconda generazione

GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO (a. ODN) m. RNA A G U … A … G … C … U … A … G … A T C G A T C C U A G a. ODN L’a. ODN si lega in modo specifico alla sequenza complementare dell’m. RNA. Il tratto di catena ibrida che così si forma determina per via enzimatica o per impedimento sterico l’inattivazione dell’intero messaggero

MECCANISMO D’AZIONE DEGLI a. ODN A- ATTIVAZIONE DA PARTE DELLA RNAsi H: Degrada la componente di RNA delle catene ibride DNA-RNA B- IMPEDIMENTO STERICO: La catena di RNA-DNA impedisce la traduzione sui ribosomi, impedendo la sintesi della proteina RNAsi H B A a. ODN NO PROTEINA Ribosoma NO PROTEINA

REQUISITI PER L’ATTIVITA’ DI UNA MOLECOLA ANTISENSO 1 Legarsi a siti accessibili dell’m. RNA target 2 Stabilità 3 Legame alla cellula ed entrata 4 Accumulo all’interno della cellula 5 Evitare la compartimentalizzazione errata 6 Localizzarsi in siti attivi (nucleo o citoplasma) nucleo CELLULA 7 Essere attivo PROTEINA DNA RNA

DISEGNO DI UN ODN 1. Uso di programmi (es. MFOLD) che predicono il “folding” dell’RNA per identificare siti di ibridazione accessibili 2. “Gene walking”: si genera una serie di ODNs contro l’m. RNA target e si valuta l’attivita’ di ciascuno in cellule o in vivo 3. “RNAsi H mapping”: si basa sul fatto che tale enzima riconosce e degrada selettivamente la catena di RNA in eteroduplex RNA-DNA. Si combina l’m. RNA target con una libreria di ODNs random in presenza di RNAsi H, l’analisi dei frammenti tagliati permette di individuare i siti accessibili 4. “ODN scanning arrays”: Si costruisce un array sintetizzando ODN che coprono ogni sito dell’RNA bersaglio, si ibrida dunque con l’RNA target radiomarcato. Questa metodologia permette di individuare la sequenza di possibili ODN

MODIFICA CHIMICA DEGLI ODN PERCHE’ ? 1 - per migliorare l’uptake cellulare 2 - per aumentare la stabilità alle nucleasi COME ? A- apportando modifiche ai gruppi ossidrili del fosforo B- all’ossidrile 3’ del ribosio C- alle basi

MODIFICHE UTILIZZATE SU ODN O O P X M W Z GRUPPO FOSFATO O O Y Base M W X P O O P Oalch O P Me O P S O P O NH P O O C H O S O O O- O O OR’ O Base ZUCCHERO OR’ OAlch 2’-O-Alchil-RNA O Base OR’ Alfa-nucleoside Y O O S O O H O Z O O O NH O CH 2 O HO fosfodiestere fosfotriestere metilfosfonato fosforotioato fosforoditioato 3’-fosforammidato 5’-fosforammidato formacetale solfonato Base OR’ arabinonucleoside O Base OR’ Omo-DNA

ALCUNI a. ODN MODIFICATI Base O O O P Base O S O Base O O O P Base O CH 3 O FOSFOROTIOATI: Sono analoghi degli a. ODN naturali in cui uno degli ossigeni non a ponte del legame fosfodiesterico è stato sostituito con un atomo di zolfo. VANTAGGI: - stabili alle nucleasi - facile sintesi - attivazione dell’RNAsi H SVANTAGGI: - poco assorbiti - modesta tossicità METILFOSFONATI: Un ossigeno non a ponte del legame fosfodiesterico è sostituito con un gruppo metilico. VANTAGGI: - minore solubilità quindi maggiore concentrazione intracellulare SVANTAGGI: - non attivano l’RNAsi H

PNA ( Peptide Nucleic Acids ) • Uno scheletro di peptidico mima struttura del DNA tipo la • Le basi mantengono tra loro la distanza che avevano nel DNA e quindi possono riconoscere le basi complementari • La sintesi segue schemi identici a quella per i peptidi • La struttura risultante è di natura non ionica, stabile alle nucleasi, proteasi e peptidasi

PNA: VANTAGGI E SVANTAGGI: - facilità di sintesi - modulabilità delle proprietà chimico-fisiche (il gruppo ammidico può essere opportunamente funzionalizzato) - grande stabilità del complesso PNA-DNA grazie alla mancanza della carica degli oligomeri di PNA - sono più resistenti all’attacco di proteasi e nucleasi SVANTAGGI: - non sono attaccati da RNAsi - non penetrano la membrana cellulare - possono non essere selettivi

APPLICAZIONI DI PNA Nel 1992 fu pubblicato il primo studio sull’applicazione di PNA: PNA microiniettati (1 m. M) nei nuclei di cellule in coltura hanno bloccato la sintesi della proteina T Ag di SV 40. Diversi gruppi hanno studiato l’effetto antisenso dei PNA in vitro su estratti nucleari di epatociti di ratto e hanno riportato un’inibizione della traduzione dell’m. RNA che codifica per il recettore a dell’IL-2, la cloramfenicolo acetiltrasferasi, l’i. NOS… Nel 1998 si hanno i primi risultati in vivo. PNA contro la neurotensina e il recettore m degli oppioidi sono stati iniettati in ratti e hanno ridotto drasticamente la risposta alla neurotensina e alla morfina. Gli effetti sono reversibili e le risposte tornano normali dopo 5 -14 giorni dall’iniezione Sono stati studiati PNA che bloccano specificamente l’interazione del fattore di trascrizione NF-k. B con il suo sito di legame nel promotore di IL 2 -Ra. PNA contro l’m. RNA della prepro-ossitocina riducono la quantità dell’m. RNA per l’ossitocina in modo tempo e dose dipendente

CONFRONTO STRUTTURA CHIMICA TRA DNA E PNA O O Base NH 2 N O O O- P O O OR’ DNA O Base O NH Base N O OH PNA Base O

FARMACOCINETICA CELLULARE DI ODN § In vitro gli ODN attraversano la membrana cellulare con un processo di pinocitosi ed endocitosi mediata da recettore. § La concentrazione intracellulare è 1 -3% di quella extracellulare, se veicolati da agenti lipofili arriva a 10 -20% § La lunghezza dell’oligo è inversamente proporzionale all’uptake cellulare § Non tutto l’ODN internalizzato esercita un effetto poiche’ gran parte e’ sequestrato nei compartimenti endosomiali o lisosomiali. § Studi in vitro dimostrano una compartimentalizzazione di ODN anche all’interno di altri organelli citoplasmatici, questo non sembra vero in vivo § L’emivita intracellulare degli oligo naturali è di 2 -4 ore. Tale emivita è decisamente influenzata dalla natura chimica dell’ODN

FARMACOCINETICA-2 § Somministrazione per via endovenosa, peritoneale, topica, oftalmica, inalatoria e orale. La via orale dà buoni livelli circolanti però l’assorbimento è irregolare § L’emivita plasmatica degli ODN naturali è assai breve, dovuta alla degradazione da parte delle nucleasi sieriche e alla captazione dai tessuti periferici (ridistribuzione). Piu’ somministrazioni sono in genere richieste per avere una certa efficacia, questo e’ particolarmente importante se il target ha un basso turnover. Esempio PERIFERINA= proteina dei filamenti intermedi tipica dei neuroni, half life=7 giorni circa, la somministrazione ripetuta di ODN per piu’ di 40 giorni porta alla riduzione del 90% di livelli di periferina § Sono disponibili sistemi impiantabili a base di polimeri biodegradabili in grado di rilasciare il composto attivo per piu’ di un mese (il rilascio e’ in funzione della chimica e lunghezza dell’ODN)

FARMACOCINETICA DEI FOSFOROTIOATI § I FOSFOROTIOATI, somministrati per via sistemica, si distribuiscono rapidamente in tutti gli organi tranne il SNC. L’assorbimento determina una rapida diminuzione dei livelli plasmatici e l’equilibrio si stabilisce entro 20 -30 minuti dalla somministrazione. § La concentrazione che si ottiene è sufficiente per l’azione farmacologica. § L’emivita è di 16 -18 ore. § L’eliminazione è degradativa (20 -30% nelle urine dopo 24 ore). Non si è osservata eliminazione fecale. § Si suggerisce per terapia sistemica 10 -50 mg/kg.

DISTRIBUZIONE ED ELIMINAZIONE DI a. ODN Doposomministrazione intravenosa gli oligo possono essere rintracciati in una varietà di tessuti con la percentuale più alta di accumulazione nel rene (cellule dei tubuli prossimali) e nel fegato (cellule endoteliali) seguiti da milza e midollo osseo e in minime quantità nelle cellule ematiche mononucleari periferiche (PBMCs).

VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-1 Data la veloce eliminazione degli ODN plasmatici liberi è necessario che essi siano specificamente veicolati verso le cellule del tessuto bersaglio. Le strategie di trasferimento degli ODN sono diverse e tutte implicano il processo di adesione alla membrana e il successivo rilascio all’interno della cellula con inclusa efficienza, stabilità ed assenza di effetti citotossici.

VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-2 1. LIPOSOMI CON LIPIDI CATIONICI I liposomi incapsulano gli ODN nel centro acquoso. I lipidi cationici dotati di carica positiva facilitano la incorporazione di DNA (a carica negativa) e il trasporto nella cellula mediante fusione con le membrane cellulari o endocitosi mediata da recettori. Per facilitare il rilascio dall’endosoma o liposoma si puo’ incorporare un lipide helper = DOPE (dioleil fosfatidiletanol amina) che distrugge la parete endosomiale. Un’altra strategia consiste nell’utilizzare liposomi p. H sensibili: a PH acido il liposoma collassa e cio’ determina la fusione con la membrana endosomiale e il rilascio del contenuto nel citoplasma.

VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-3 2. NANOPARTICELLE E MICROSFERE: Le NANOPARTICELLE sono veicolanti colloidali di dimensioni nanometriche. Sono costituite da polialchil-ciano-acrilati (PACA), molto biodegradabili e a basso costo. Poiche’ hanno superficie carica negativamente si utilizzano copolimeri cationici o detergenti idrofobi cationici per facilitare il legame dell’ODN che rimane adsorbito alla superficie carica Le MICROSFERE hanno dimensioni comprese tra 1 e 100 mm, sono a base di zuccheri biodegradabili che consentono il rilascio ritardato di acidi nucleici. P(LA-GA) sono le piu’ usate

VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-4 3. RILASCIO MEDIATO DA UN PEPTIDE CARRIER: Una delle più potenti strategie per il rilascio all’interno delle cellule di ODN è basata sull’uso di un breve peptide chiamato MPG (27 residui). MPG contiene un dominio idrofobico derivato dalla fusione di sequenze gp 41 dell’HIV ed un dominio idrofilico derivato dalla sequenza dell’antigene T dell’SV 40. MPG ha un’alta affinità per il DNA sia a singola elica che a doppia elica. I legami principali tra MPG e l’ODN avvengono attraverso interazioni elettrostatiche coinvolgono residui basici del peptide vettore. Il rapporto MPG/ODN deve essere molto elevato (dell’ordine di 20/1). Questa nuova strategia offre diversi vantaggi rispetto agli altri approcci comunemente in uso, aumentando la stabilità degli ODN nei confronti delle nucleasi e facilitando l’attraversamento della membrana plasmatica.

VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-5 4. VIRUS: Durante l’assemblaggio del capside l’ODN terapeutico viene incorporato nello spazio intravirale sostituendo il contenuto nucleico originale. 5. CONIUGAZIONE: Composti coniugati con oligonucleotidi: § LIGANDI (ferritina, porfirina, EGF, anticorpi): potenziano l’uptake cellulare per endocitosi e per via recettoriale § LIPIDI (colesterolo, PEG, poli L-lisina): aumentano il passaggio passivo attraverso le membrane e incrementano la stabilità § INTERCALANTI (psoralene, acridina, antracicline): accrescono la stabilità della doppia elica § MARCANTI (biotina, fluoresceina)

TOSSICOLOGIA CELLULARE DEGLI ODN § Solo per concentrazioni superiori a 100 m. M § Possono causare 10 -20% di inbizione della proliferazione cellulare forse per ibridazioni parziali aspecifiche § Non sono state mai descritte mutazioni permanenti per inserimento degli oligo nel DNA § Non sono state mai descritte trasformazioni neoplastiche

TOSSICOLOGIA IN VIVO TOPO DL/50 RATTO DL/50 350 mg/kg I. V e I. P. 100 mg/kg/giorno/3 mesi Sofferenza epatica solo in caso di somministrazione di tioati. Non ci sono effetti teratogeni

a. ODN: SETTORI DI UTILIZZO TERAPEUTICO-1 1. CONTROLLO DELLA CRESCITA NEOPLASTICA: PRIMA GENERAZIONE: a. ODN contro m. RNA importanti nel ciclo mitotico (subunità a polimerasi, myc. . ) SECONDA GENERAZIONE: a. ODN contro le traslocazioni cromosomiche di linfomi e leucemie 2. TERAPIA ANTIVIRALE: HIV: SIDA blocco delle proteine essenziali per il ciclo riproduttivo (TAT, REF) Herpes Simplex: impiego clinico per cheratite erpetica Virus influenzali

a. ODN: SETTORI DI UTILIZZO TERAPEUTICO-2 4. CARDIOLOGIA: § Ipertensione: a. ODN contro geni che sintetizzano per molecole vasoattive (renina-angiotensina, recettore adrenergico, endotelina e neuropeptide Y, callicreina, peptide natriuretico atriale, NO, calcitonina) § Ischemia miocardica § Nel controllo della ristenosi sono utilizzati per inibire la proliferazione endotelio-intima muscolare delle arterie coronariche dopo stress meccanico (azione sull’m-RNA che codifica per il PDGF)

AODN IN VIROLOGIA 1. esperimenti su animali da laboratorio hanno evidenziato un effetto anti -HIV di un ODN di 28 mer complementare al gene tat dell’HIV. In pazienti con AIDS conclamata, utilizzato alla concentrazione di 3, 6 mg/kg per via endovenosa, non ha dato effetti positivi. Attualmente la Hybridon sta studiando una sequenza (GEM 91) che sembra bloccarenon solo la replicazione dell’HIV ma anche inibire il suo legame alle cellule. 2. ODN contro Citomegalovirus = FOMIVIRSEN (Vitravene. TM), responsabile della cecità registrata in alcuni pazienti affetti da AIDS. Somministrazione topica per via intra-oculare. Approvato nel 1998 per il commercio in USA e nel 1999 per l’Europa 3. ODN anti influenzale. Blocca l’espressione del gene ICAM 1 che funge da recettore per il passaggio del virus all’interno della cellula 4. ODN contro Papillomavirus (HPV) probabilmente responsabile del tumore della cervice uterina. Somministrazione intra-papilloma o per pomata

a. ODN IN ONCOLOGIA § I GENERAZIONE Studi di somministrazione topica di DNA associato a nanoparticelle che ha come bersaglio il gene Ras, somministrato a pazienti con carcinoma alla vescica § II GENERAZIONE Tumori sistemici (leucemie e linfomi): ODN diretti ad ibridizzare le sequenze originate dalla traslocazione cromosomica 8: 14 nel linfoma di Burkitt, 9: 21 (cromosoma Filadelfia) nella leucemia mieloide cronica, 14: 18 nella leucemia B umana.

LEUCEMIA B UMANA Ch. 18 bcl-2 V bcl-2 N J 6 E D J E Ig. H Ch. 14 A) Ig. H B) C) sequenza specifica bcl-2 Ig. H 5’ TGCAGTGGTGCT CCCTGGTTCCCCGAA TACTACTACCTA 3’ Traslocazione cromosomica 14: 18. A) La doppia rottura del cromosoma 18 nel gene bcl-2 e del cromosoma 14 nel locus della catena pesante delle immunoglobuline (Ig. H) determina (B) la formazione del gene ibrido bcl-2 -Ig. H formando una sequenza nucleotidica specifica nel punto di giunzione (C).

a. ODN CONTRO GENI CANCRO-CORRELATI-1 C-myc: Inibizione della proliferazione sia nei linfociti T sia delle cellule HL 60, le quali sono indotte ad un differenziamento spontaneo; inibizione della crescita di una linea tumorale derivata da un linfoma di Burkitt C-myb: Inibizione dell’attività proliferativa delle cellule mieloidi in coltura, dei precursori emopoietici mieloidi nrmali e dei Tlinfociti PHA stimolati C-abl: Parziale inibizione della capacità proliferativa e della formazione di colonie mieloidi Cdc 2: Inibizione della proliferazione dei linfociti T PHA stimolati Bcl-2: Inibizione della proliferazione di cellule leucemiche con massiva morte cellulare

a. ODN CONTRO GENI CANCRO-CORRELATI-2 CSF-1: Prevenzione della senescenza di cellule endoteliali umane, aumento della capacità proliferativa BCR/ABL: Soppressione della formazione di colonie di cellule di leucemia mieloide cronica P 53: Soppressione della formazione di colonie di cellule di leucemia mieloide acuta Protimosina a: Inibizione della proliferazione delle cellule mielomatose Butirrilcolinesterasi: Inibizione selettiva della megacariocitopoiesi

EFFETTO ANTITUMORALE DI a. ODN ANTI-MYB 10 Non trattati ODN controllo 8 a. ODN anti-myb 6 4 2 0 0 12 24 36 48

ODN IN ALTRE PATOLOGIE PSORIASI: ODN per diminuire la velocità di proliferazione delle cell della pelle o contro un difetto del sist imm. RETINITE indotta da infezione da citomegalovirus: Vitravene TRATTAMENTO DELL’ASMA: L’Hybridon ha messo a punto un antisenso in grado di inibire le espressioni delle interleuchine durante la risposta immunitaria. MORBO DI CROHN: ISIS 2302 e’ in fase II, esso inibisce la sintesi di una proteina di adesione cellulare che favorisce il passaggio delle cellule infiammatorie attraverso i vasi sanguigni SCLEROSI MULTIPLA: la ISIS ha cercato di mettere a punto un ODN contro il recettore VLA 4 sulla superficie dei linfociti per bloccare l’inappropriata migrazione di linfociti nel SNC che contribuisce alla patogenesi della malattia DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE: effetto positivo di rattamenti intramuscolari

Dystrophin is a rod-shaped cytoplasmic protein, and a vital part of a protein complex that connects the cytoskeleton of a muscle fiber to the surrounding extracellular matrix through the cell membranes. This complex is variously known as the costamere or the dystrophin-associated protein complex. Many muscle proteins, such as α-dystrobrevin, syncoilin, synein, sarcoglycan, dystroglycan, and sarcospan, colocalize with dystrophin at the costamere. As of 2007, dystrophin is the longest gene known, covering 2. 4 megabases (0. 08% of the human genome) at locus Xp 21. Theprimary trancript measures about 2, 400 kilobases and takes 16 hours to transcribe, the mature m. RNA measures 14. 0 kilobases. The 79 exons code for a protein of over 3500 amino acid residues.

PTC 124; Ataluren; 3 -(5 -(2 -fluorophenyl)-1, 2, 4 -oxadiazol-3 -yl)benzoic acid; 3 -[5 -(2 fluorophenyl)-1, 2, 4 -oxadiazol-3 -yl]benzoic acid PTC 124 is a novel small-molecular agent that makes ribosomes less sensitive to stop codons. However, it is not equally effective with every stop codon, working best on the sequence 'UGA'.

Exon skipping: una nuova applicazione per oligonucleotidi Antisenso: l’esempio della patologia di Duchenne 1.

Exon skipping: una nuova applicazione per oligonucleotidi Antisenso: l’esempio della patologia di Duchenne 2.

Utilizzodi acidi nucleici per alterare la maturazione di RNA

PROBLEMATICHE RIGUARDANTI GLI ANTISENSO IN TERAPIA 1. Scarsa riproducibilità negli esperimenti in colture cellulari 2. Uso fosforotioati 3. Variabilità del grado di purezza delle diverse preparazioni 4. Uptake cellulare ancora poco definito 5. Costo

ODN DI SECONDA GENERAZIONE-1 Proprietà biologiche Affinità Substrato dell’Rnasi H Farmacocinetica cellulare Proprietà farmacocinetiche Stabilità in vivo Rilascio sito specifico Emivita plasmatica

ODN DI SECONDA GENERAZIONE-2 Il modello di oligonucleotide deputato ad assolvere tutte queste funzioni e a mostrare tutte queste proprietà sembra rappresentato dalla classe degli MBO (mixed backbone oligonucleotides). Un ODN chimerico ultimamente approntato possiede una breve sequenza di DNA fosforotioato (3 -9 basi) usata per attivare l’Rnasi H e un braccio ibridizzante fornito di nucleotidi modificati che non formano substrati per l’Rnasi H. Nucleotidi 2’-O-Metil o 2’-fluoro modificati sono stati usati per i bracci ibridizzanti. Il gruppo 2’-O -metile incrementa l’affinità dell’oligomero per l’RNA target e ne aumenta l’attività in coltura. Gli MBO mostrano una elevata stabilità in vivo che potrebbe consentire somministrazioni meno frequenti nonché meno gravi effetti locali legati alla natura polianionica e alla risposta immunitaria. Questo è dovuto al ridotto numero di legami fosforotioati contigui oltre che alla posizione centrale dei segmenti modificati.