Controle Microbiolgico de Produtos Farmacuticos e Cosmticos No
Controle Microbiológico de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos Não Estéreis • QUESTÕES DE PROVAS; • CONTEÚDO DAS PRÓXIMAS AULAS; • HORÁRIO DE ATENDIMENTO ON-LINE; blog do professor: http: //chitoteixeira. wordpress. com/
Aspectos Gerais Em condições ordinárias de uso terão contato com áreas portadoras de flora Produtos não estéreis são aqueles nos quais se microbiana natural, constituída de saprófitas em número por vezes elevado; admite conceitualmente a presença de carga A atenção no controle dos produtos não estéreis assegura que a carga microbiana, tendo emou vista as microbiana presenteembora no produto, limitada, seja no aspecto qualitativo quantitativo, não comprometa a sua qualidade final ou a segurança do paciente; características de sua utilização; Produtos cosméticos De administração oral ou tópica
Aspectos Gerais O objetivo imediato é comprovar a ausência de microrganismos patogênicos e determinar o número de microrganismos viáveis, em função dos tipos de utilização do produto;
Padrões Microbianos As primeiras inclusões de limites microbianos aplicados a produtos farmacêuticos e seus insumos ocorreram de forma vaga, como a recomendação de “ausência de emboloramento”; 11ª e 12ª edições da USP: 1936 e 1942, respectivamente; No formulário Nacional de 1970 e na 18ª Edição da Farmacopéia, do mesmo ano, a expressão foi modificada para:
Padrões Microbianos “Drogas vegetais e animais deverão estar, o máximo possível, isentas de microrganismos, sendo que os patogênicos não deverão estar presentes”; É interessante lembrar que o primeiro insumo farmacêutico com especificação relativa à qualidade microbiológica foi a gelatina, na USP XII de 1942, com o limite tolerado, em função de sua origem, de 104 bactérias totais por grama; Esta especificação foi alterada diversas vezes, tendo passado por 5 x 103/g, na 18ª Edição; 104/g, na edição seguinte e, finalmente, 103/g a partir da 20ª Edição;
Padrões Microbianos Além dessa exigência quantitativa havia outro requisito, isto é, ausência de patógenos específicos numa determinada tomada de ensaio, sendo que este aspecto foi se tornando mais exigente; Com a tomada de ensaios de: 10 mg ou menos – USP XII; ALTERADA PARA 10 mg – USP XVI; 10 g ou menos – USP XVIII; ALTERADA PARA
Padrões Microbianos Em relação aos fitoterápicos, a Portaria nº 123 de 19 de outubro de 1994, na Norma Técnica para Registro de Fitoterápicos, estabelece a seguinte especificação para matérias-primas vegetais: Menos que 105/g de total de viáveis; Menos que 104/g de leveduras ou fungos; Menos que 103/g de enterobactérias; Ausência de Salmonella sp. , P. aeruginosa, S. aureus, E. coli e fungos da família Aspergillus;
Padrões Microbianos Apesar do reconhecimento, há muitos anos, da importância do controle microbiano de produtos não estéreis, a implantação e aceitação dos padrões sanitários tem ocorrido lentamente; Produtos cosméticos Quanto aos produtos cosméticos, a CTFA (Cosmetic Toiletry and Fragrance Assoc. ) adotou limites de tolerância que se tornaram referência internacional. Estes limites são não mais que 500 microrganismos por grama em produtos para bebês e naqueles utilizados na área dos olhos e de não mais que 1000 microrganismos por grama para todos os outros, além de mencionar que nenhum produto deve ter conteúdo microbiano considerado nocivo para o usuário;
Métodos de Análise Envolvem tanto os medicamentos não estéreis quanto os cosméticos, abrangem três etapas fundamentais: transporte e preparação da coleta; amostra Amostragem – englobando para análise;
Métodos de Análise Determinação numérica ou contagem das formas viáveis;
Métodos de Análise Isolamento e identificação dos microrganismos indesejáveis a serem pesquisados;
Amostragem A amostragem a ser efetuada para investigação quanto ao atendimento aos padrões microbianos deve ser: Em termos de abrangência do volume contido, do número de unidades contenedoras, e das operações unitárias envolvendo risco de contaminação adicional ou proliferação microbiana; Representativa Em se tratando de sacos ou barricas contendo matéria-prima não estéril na forma pulverizada, dispositivos de amostragem devem permitir a obtenção de frações da parte inferior, mediana e superior de cada um de (raiz de N ou raiz de N + 1) do número total dos recipientes;
Amostragem Nos processos contínuos, a segmentação como início, meio e fim do processo deve estar contemplada na amostragem; Considerando o produto terminado, toma-se via de regra duplicata ou triplicata da amostra, representando início, meio e fim do processo de enchimento, admitindo que após o fechamento do material de acondicionamento a introdução de contaminantes não mais existirá; O transporte deve ser em condições adequadas de temperatura;
Amostragem Quantidade a ser analisada: A recomendação das principais farmacopéias, para enriquecimento na pesquisa de patogênicos é, geralmente, de 10 g(m. L), além da contagem total em igual quantidade; No caso do volume total da amostra ser de 10 g(m. L), ou inferior, este total deve ser analisado. A tomada de ensaio pode ser reduzida para 1 g(m. L) em amostras de produtos de alto valor agregado;
Amostragem Preparação da amostra: A primeira preocupação ao preparar a amostra consiste na verificação da atividade antimicrobiana do produto devido à presença de conservantes na fórmula; Estes devem ser inativados com substâncias adequadas, conforme sua natureza química;
Amostragem Preparação da amostra: A adição dos inativantes, previamente esterilizados por algum dos processos eficientes, deve ser previamente validada; Outro cuidado importante, para não impedir o crescimento microbiano, é o ajuste do p. H do produto diluído para a faixa da neutralidade;
Amostragem Preparação da amostra: A homogeneização da amostra é fundamental no sentido de conduzir a transferência para etapas subsequentes de forma representativa, ainda que a mesma tenha sido diluída por exemplo em solução salina peptonada (0, 1 %), solução tamponada (p. H 7, 0) ou caldo lactose; Algumas formas farmacêuticas ou cosméticas poderão exigir tratamento específico, no sentido de permitir o contato íntimo da amostra com o meio diluente: Assim, no caso de produtos em aerossol, em que a tomada de amostra pode considerar o peso da embalagem antes e após expelir alíquotas do produto e propelente, este será naturalmente eliminado;
Amostragem Preparação da amostra: Forma de manuseio operacional trabalhosa é o sabonete, que exige fragmentação criteriosa, seguida de leve aquecimento, recurso também aplicável no caso de supositórios e pomadas; Produtos com fase oleosa exigem a adição de agente tensoativo, cuja concentração deve ser cuidadosamente definida para evitar efeito inibidor sobre possíveis microrganismos contaminantes; Agente tensoativo
Métodos de Contagem de Microrganismos • Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate); • Em meio sólido, com semeadura da amostra em superfície; • Membrana filtrante; • Número mais provável;
Métodos de Contagem de Microrganismos Pour Plate: Consiste na transferência de alíquota de 1 a 2 m. L da diluição da amostra (de cada diluição a ser considerada) para réplicas de placas de Petri estéreis (usualmente de 2 a 3 a cada diluição); O meio de cultura estéril fundido e resfriado a 45 – 48°C, em quantidade de cerca de 20 m. L, é vertido sobre cada uma das placas contendo amostra, realizamos então a homogeneização com movimentos em S ou 8 sobre a bancada de trabalho, as quais permanecem até solidificação a temperatura ambiente;
Métodos de Contagem de Microrganismos Pour Plate: Segue-se incubação das placas, em estufa, na posição invertida; Após 2 a 5 dias de incubação a 30 – 35°C, para bactérias e 5 a 7 dias para bolores e leveduras, a 20 – 25°C, as colônias são contadas;
Métodos de Contagem de Microrganismos Pour Plate: Para contagem total de bactérias os meios oficialmente recomendados são principalmente ágar caseína-soja e ágar nutriente; Para fungos, ágar Sabouraud-dextrose e ágar batata;
Métodos de Contagem de Microrganismos Semeadura da amostra em superfície: O meio de cultura é preparado e distribuído previamente em placas de Petri. Empregando-se pipetas estéreis, volumes de 0, 1 a 0, 5 m. L de cada diluição considerada são distribuídos na superfície do gel já solidificado, sendo o espalhamento efetuado com movimentos cuidadosos ou com o auxílio de bastão de vidro ou alça de Drigalski; A escolha do meio de cultura, condições de incubação e Na dependência da densidade da amostra, cálculos para determinação da absorção carga contaminante haverá total pelo meio. Asviável placas invertidas são então equivalem ao descrito para a técnica Pourincubadas; Plate;
Métodos de Contagem de Microrganismos Membrana filtrante: Alíquotas do produto sob forma líquida ou suas diluições são filtradas através de membranas apropriadas (0, 45 mm ou 0, 20 mm de poro e 47 mm de diâmetro, constituídas em derivados celulósicos), seguindo-se a deposição das membranas, na mesma posição, sobre placas contendo meio de cultura; O cálculo para contaminantes anteriormente; Esta metodologia é vantajosa por permitir volumes elevadostotal na amostragem e pela determinar o número de acuidade, apresentando recomendação viáveis éespecial igualpara aoamostras descrito contendo agentes antimicrobianos;
Métodos de Contagem de Microrganismos Número mais provável (NMP): A determinação do NMP de microrganismos se baseia em estimativa fundamentada em probabilidade. Assim, indica o valor dentro de uma faixa que reflete o número de microrganismos presente; Embora apresentando imprecisão maior que os outros métodos descritos, é ainda recomendado e muito empregado, inclusive como método oficial, no controle microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos e águas;
Métodos de Contagem de Microrganismos Número mais provável (NMP): Uma vantagem de seu emprego consiste em permitir melhor revitalização dos microrganismos debilitados, em função do perfeito contato da amostra com o meio de cultura, enquanto o uso do meio sólido fundido seria fator adicional de estresse, uma vez que a temperatura do meio, no momento da homogeneização da amostra não seria favorável a esses contaminantes; Embora permita avaliação de amostras com níveis elevados de contaminação, sua indicação é para situações nas quais se espera valores baixos de contagem;
Métodos de Contagem de Microrganismos Número mais provável (NMP): A metodologia emprega meios líquidos, usando-se diluições seriadas amostras inoculadas nos mesmos. Exige a disponibilidade de tabelas estatísticas específicas para obtenção de resultados a partir das leituras; O número de réplicas empregadas a cada diluição pode variar, sendo mais comuns tabelas construídas a partir de 3 ou 5 réplicas. No cálculo de contaminantes da amostra deve ser considerado ainda o fator de diluição utilizado;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Procedimentos: Os procedimentos básicos sofrem pequenas distinções entre os compêndios oficiais de diferentes países, entretanto os aspectos básicos são mantidos; Meios de Enriquecimento: As tomadas de ensaio recomendadas são da ordem de 10 g(m. L), quantidade que pode ser simultaneamente usada para promover o enriquecimento não seletivo; Para pesquisa de E. coli e Salmonella sp. , em 100 m. L de caldo lactose e para pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, 100 m. L de caseína-soja;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Enriquecimento: A incubação deve ser a 36 ± 1°C, durante 24 a 48 horas; Para Salmonella sp. , procede-se também ao enriquecimento seletivo, tomando-se volumes de 10 m. L da suspensão resultante do enriquecimento não seletivo, para os caldos tetrationato e selenito-cistina, em volumes de 100 m. L, então incubados em estufa, durante 24 horas a 36 ± 1°C; Meios de Diferenciação: Após enriquecimento, alíquotas são transferidas, por repique, no geral por estria ou por picada, para meios de cultura para isolamento e de diferenciação;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Espalhamento nos quatro quadrantes Ágar semi-sólido para Repique por picada provas de motilidade com movimento em S
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Staphylococcus aureus; Ágar Baird-Parker (colônias pretas, halo transparente): De uso específico para estafilococos coagulase-positivos, este meio contém cloreto de lítio e telurito em concentrações que inibem a flora acompanhante; Simultaneamente, o piruvato e a glicina estimulam seletivamente o crescimento de estafilococos; Devido à presença de gema de ovo no meio de cultura, as colônias de estafilococos apresentam halos transparentes originados por lipólise ou proteólise; o meio de cultura é opaco devido à lecitina. Adicionalmente, é originada a coloração negra devido à redução do telurito;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Staphylococcus aureus; Ágar Vogel-Johnson (colônias pretas, halo amarelo): Trata-se de meio adequado para a investigação de estafilococos manitol-positivos. Considerando a capacidade de redução do telurito e a fermentação do manitol deste grupo de microrganimos; A concentração elevada de manitol e a adição de vermelho de fenol como indicador de p. H facilitam a visualização desta característica; Os estafilococos em geral apresentam-se tolerantes frente a concentrações elevadas de sais como cloreto de sódio e cloreto de lítio. Este ágar devido à presença de cloreto de lítio, inibe o crescimento de microrganismos indesejáveis. A produção de ácido a partir de manitol é responsável pelo halo amarelo característico;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Staphylococcus aureus; Ágar Manitol (colônias amarelas, halo amarelo): Caracteriza-se por formulação adequada para a investigação de estafilococos. Devido à elevada concentração salina impede o crescimento da maioria das outras bactérias, exceto alguns microrganismos halófilos. A degradação do manitol a ácido é comprovada pela viragem do indicador de p. H vermelho de fenol;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Pseudomonas aeruginosa; Ágar Cetrimida (colônias esverdeadas, com fluorescência): Emprega brometo de sal para de amônio quaternário de cetiltrimetilamonio Ágar Pseudomonas Piocianina (cetrimida) agente seletivo, notável poder inibitório sobre (colônias como esverdeadas, com fluorescência azul): microrganismos distintos de Pseudomonas aeruginosa; Valoriza a detecção do pigmento piocianina, reconhecido pela Ágar Pseudomonas para Fluoresceína Tanto a formação fluorescência azul; do pigmento verde piocianina como o aspecto (colônias claras e amarelas, com fluorescência fluorescente das colônias à luz ultravioleta ocorrem nesteamarela): meio; Também de composição semelhante, porém facilitando a visualização da fluorescência amarelo-esverdeada;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Escherichia coli; Ágar Mac Conkey (colônias vermelho-tijolo a púrpura, com halo de precipitação de bile): Consiste em meio seletivo para o isolamento de Salmonelas e bactérias coliformes, característica decorrente de seus componentes sais biliares e cristal violeta, que inibem a flora Gram (+); A lactose, também presente na composição, tem sua degradação evidenciada devido à presença do indicador de p. H vermelho neutro; As colônias lactose-negativas são incolores (Salmonella sp. ) e as lactose-positivas são vermelho-violeta com halo turvo, devido à diminuição do valor de p. H e a precipitação dos ácidos biliares (Escherichia coli), ou rosadas e mucóides (Enterobacter, Klebsiella);
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Escherichia coli; Ágar Eosina-Azul de Metileno (EMB) (colônias vermelhoescuras, brilho metálico): Usualmente empregado na identificação de Escherichia coli, este meio de cultura apresenta conteúdo rico em corantes, que inibe os microrganismos Gram (+); Enquanto colônias de Enterobacter aerogenes se apresentam com centro cinzento, aquelas de Escherichia coli, graças à sua interação com a eosina e o azul de metileno, apresentam colônias típicas com brilho metálico esverdeado e centro escuro, inconfundíveis;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Escherichia coli; Ágar Endo (colônias rosadas a vermelhas, brilho metálico): Meio de cultura para identificação de coliformes fecais, devido ao seu conteúdo de sulfito sódico e fuccina reprime consideravelmente o crescimento de bactérias Gram (+); Os coliformes que degradam a lactose produzem aldeído e ácido. O aldeído, por sua vez, libera fuccina a partir da combinação fuccinasulfito, conferindo às colônias a coloração vermelha. No caso de Escherichia coli esta reação apresenta tal intensidade que promove a cristalização da fuccina, o que resulta em coloração das colônias com brilho metálico estável, com reflexos verdes;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Salmonella sp. ; MEIOS DE ENRIQUECIMENTO SELETIVO – Caldo Selenito-Cistina e Caldo Tetrationato; MEIOS DE ISOLAMENTO – Ágar Verde Brilhante (coloração transparente) e Ágar Sulfito de Bismuto (colônia preta ou esverdeada); O efeito seletivo destes meios de cultura baseia-se no seu conteúdo de verde brilhante, inibindo a flora Gram (+) acompanhante. O efeito diferenciador deve-se ao fato de as colônias de microrganismos fortemente redutores apresentarem uma elevada pressão de elétrons Portanto, no centro colônias ocorre redução a sulfeto de ferro, na parte central, quedestas diminui na periferia; ocorrendo a coloração negra. Ao redor, apenas é possível a redução dos íons bismuto a bismuto metálico, acarretando o surgimento de brilho metálico na periferia da colônia;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Salmonella sp. ; Ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (colôn. Vermelhas, núcleo negro): Devido à sua composição, e particularmente graças ao conteúdo reduzido de desoxicolato, é adequado para demonstrar a presença de Salmonella e Shigella; A degradação dos açucares xilose, lactose e sacarose da sua composição a ácido promove a viragem do indicador de p. H vermelho de fenol a amarelo, indicativo de outras bactérias; O tiossulfato serve como substância de reação e o sal de Ferro (III) como indicador da formação de sulfeto de hidrogênio, visualizado então nas colônias negras de sulfeto de ferro;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Salmonella sp. ; Ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (colôn. Vermelhas, núcleo negro): As bactérias que descarboxilam lisina à cadaverina são reconhecidas por promoverem a coloração púrpura ao redor das colônias, devido à elevação do valor de p. H; Várias destas reações podem ocorrer simultânea e sucessivamente, permitindo originar matizes de coloração; Também, incubações prolongadas podem promover inversões de viragem do indicador de p. H, podendo ser inclusive devido à evaporação dos ácidos formados;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Salmonella sp. ; Ágar Tríplice Açucar-Ferro (coloração avermelhada na superfície, amarela no fundo, precipitação de sulfeto de ferro): Possibilita a investigação de Proteus, Hafnia, Providencia e outras bactérias que não fermentam a lactose ou o fazem muito lentamente, mas que fermentam a sacarose de maneira relativamente rápida; A degradação de açúcar com formação de ácido pode ser comprovada pelo indicador vermelho de fenol, que passa para a coloração amarela, e a alcalinização decorre em cor vermelho-escura (Salmonella sp. ). O tiossulfato sofre redução a sulfeto de hidrogênio por alguns microrganismos, o que por reação com sal férrico produz sulfeto de ferro, de cor negra;
Pesquisa de Patogênicos Específicos Meios de Diferenciação: Salmonella sp. ; Ágar Tríplice Açucar-Ferro (coloração avermelhada na superfície, amarela no fundo, precipitação de sulfeto de ferro): O volume de meio de cultura dispensado no tubo e a sua solidificação são de forma a permitir que haja, no mesmo, uma porção inclinada para repique por estria superficial, e uma coluna na parte inferior para repique por picada, em profundidade;
Provas Adicionais Havendo suspeita de presença destes microrganismos, e coerência com a característica micromorfológica, deve ser seguida a pesquisa empregando outras provas bioquímicas e sorológicas específicas conforme se faça necessário; Capacidade de fermentação de diferentes açúcares; Potencial de aproveitamento de sais amoniacais como única fonte de nitrogênio e de citrato como única fonte de carbono (ágar citrato); Formação de acetoína (reação positiva de Voges. Proskauer), reação de peroxidase, coagulase e outros;
OBRIGADO
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