CONTRLES MICROBIOLOGIQUES DES PRODUITS PHARMACEUTIQUES ET COSMTIQUES COSMTIQUES
CONTRÔLES MICROBIOLOGIQUES DES PRODUITS PHARMACEUTIQUES ET COSMÉTIQUES
COSMÉTIQUES
Législation Règlement (CE) n° 1223/2009, (entré en application dans sa totalité le 11 Juillet 2013) Les produits cosmétiques devraient être sûrs dans des conditions d’utilisation normales ou raisonnablement prévisibles • Elaboration d’un dossier d’information – Rapport sur la sécurité du produit cosmétique, personne responsable = pharmacien/médecin • Obligation de respecter les BPF : norme NF EN ISO 22 716 (publiée en janvier 2008) • Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des microorganismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus peu résistants. • De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une teneur en eau permettant la multiplication microbienne. Ils contiennent des conservateurs afin de limiter cette prolifération. • Différents contrôles et recherches microbiologiques sont réalisés sur les produits cosmétiques afin d’évaluer leur niveau d’hygiène et de prévoir leur comportement vis-à-vis d’éventuelles contaminations.
Législation Règlement (CE) n° 1223/2009, (entré en application dans sa totalité le 11 Juillet 2013) • Elaboration d’un dossier d’information – Rapport sur la sécurité du produit cosmétique • Obligation de respecter les BPF : norme NF EN ISO 22 716 (publiée en janvier 2008) • Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des microorganismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus peu résistants. • De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une teneur en eau permettant la multiplication microbienne. Ils contiennent des conservateurs afin de limiter cette prolifération. • Différents contrôles et recherches microbiologiques sont réalisés sur les produits cosmétiques afin d’évaluer leur niveau d’hygiène et de prévoir leur comportement vis-à-vis d’éventuelles contaminations.
Exemples de produits à faible risque Risque microbiologique 2) Risque microbiologique • La norme ISO 29621: 2010. Appréciation du risque microbiologique Les produits finis évalués à faible risque par cette norme ne nécessiteront pas la mise en œuvre des normes microbiologiques relatives aux cosmétiques Facteur physicochimique Limite Exemple p. H ≤ 3, 0 Soins peeling (acide glycolique) p. H ≥ 10, 0 Produits défrisants Éthanol ou autre alcool ≥ 20 % Laques, toniques, parfums Température de remplissage ≥ 65, 0 °C Pommades pour les lèvres, rouges à lèvres, fards à joues Activité de l'eau, aw ≤ 0, 75 a Pommades pour les lèvres, rouges à lèvres, fards à joues Produits à base de solvants Vernis à ongles Oxydants Colorants capillaires Chlorhydrate d'aluminium ≥ 25 % Anti-transpirants
Risque microbioogique • L'analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels que : – – l'altération potentielle des produits cosmétiques; le caractère pathogène des micro-organismes; le site d'application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux, muqueuses, etc. ); la catégorie d'utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans, etc. ). • recherche d'agents pathogènes pour la peau – Staphylococcus aureus, – Pseudomonas aeruginosa – Candida albicans • recherche des indicateurs de contamination fécale pour détecter une défaillance de l'hygiène au cours du processus de fabrication. – Escherichia coli
Analyses microbiologiques Laboratoire de microbiologie Recherche R & D Formulation Fabrication conditionnement Principe actifs conservateurs Effet inhibiteur des conservateurs Sensibilité microbiologique (ISO 9621: 2010) Challenge test (ISO 11930) Fabrication en Validation du neutralisant pour le pilote dénombrement Echelle industrielle Contrôle d’atmosphère Contrôle des surfaces Contrôle de l’hygiène du personnel Contrôle microbiologique du produit vrac Contrôle du produit fini - dénombrement et détection de la FMA - dénombrement des levures /moisissures - détection des pathogènes
Contrôle des produits finis Référentiels pour le contrôle • Pharmacopée EU 8. 0 (janvier 2014): (harmonisée) Cosmétique = médicament à usage cutané – paragraphe 2. 6. 12 : Contrôle microbiologique des produits non stériles : essais de dénombrement microbien – paragraphe 2. 6. 13 : Contrôle microbiologique des produits non stériles : recherche de microorganismes spécifies • Normes ISO – – – – NF EN ISO 21 148 : généralités(2009) NF EN ISO 21 149 : dénombrement et détection de la flore mésophile aérobie (2009) NF EN ISO 16 212: dénombrement des levures moisissures (2011) NF EN ISO 22 718: détection Staphylococcus aureus (2009) NF EN ISO 21 717 : détection Pseudomonas aeruginosa (2009) NF EN ISO 21 148 : détection Escherichia coli (2009 NF EN ISO 18 416 : détection Candida albicans (2009) NF EN ISO 18 415 : détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés (2011)
Contrôle des produits finis Préparation de la suspension mère : • le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où l’inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min • La suspension mère est préparée à partir d’un échantillon d’au moins 1 g ou 1 ml du produit d’essai mélangé avec soin. Produit miscible à l’eau Produit non miscible à l’eau V m. L de diluant-neutralisant V m. L de diluant neutralisant + polysorbate 80 Dilution d= 1/10 S (g ou m. L) de produit S = 1 g produit de catégorie 2 S= 5 g produit de catégorie 1 S (g ou m. L) de produit
Contrôle des produits finis Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit Composés chimiques pouvant neutraliser l'activité antimicrobienne des conservateurs Conservateur Produits phénoliques: parabens, phénoxyéthanol, phényléthanol, etc. Anilides Ammoniums quaternaires Exemples de neutralisants adéquats et de liquides de rinçage [6] [7] (pour les méthodes de filtration sur membrane) Lécithine Polysorbate 80, 30 g/l + lécithine, 3 g/l. Polysorbate 80 Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras, 7 g/l + lécithine, 20 g/l + polysorbate 80, 4 g/l. Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras Bouillon neutralisant D/Ea. Tensioactifs non ioniques Lécithine, saponine, polysorbate 80, dodécylsulfate de sodium Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone, 1 g/l + Na. Cl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l. Polysorbate 80, 30 g/l + dodécylsulfate de sodium, 4 g/l + lécithine, 3 g/l. Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l. Tensioactifs cationiques Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras Bouillon neutralisant D/Ea. Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone, 1 g/l + Na. Cl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l. Aldéhydes Agents générateurs de formaldéhyde Lécithine, 3 g/l + polysorbate 80, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l. Glycine, histidine Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l + L-cystéine, 1 g/l. Bouillon neutralisant D/Ea. Liquide de rinçage: polysorbate 80, 3 g/l + L-histidine, 0, 5 g/l. Oxydants Isothiazolinones, imidazoles Thiosulfate de sodium, 5 g/l. Liquide de rinçage: thiosulfate de sodium, 3 g/l. Lécithine, saponine Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l. Amines, sulfates, mercaptans, bisulfite de sodium, thioglycolate de sodium Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + Na. Cl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l. Biguanides Lécithine, saponine, polysorbate 80 Sels métalliques (Cu, Zn, Hg) Bisulfite de sodium, L-cystéine Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l. Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + Na. Cl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l. Thioglycolate de sodium, 0, 5 g/l ou 5 g/l. L-cystéine, 0, 8 g/l ou 1, 5 g/l. Organo-mercuriels Composés sulfurés, acide thioglycollique Bouillon neutralisant D/Ea. Liquide de rinçage: thioglycolate de sodium, 0, 5 g/l.
Contrôle des produits finis Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit • la neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit doit être vérifiée et validée • La validation est réalisée en contaminant le produit avec des souches de référence et en effectuant le dénombrement contre un témoin sans produit. – Staphylococcus aureus ATCC 6538 – Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ou E. coli ATCC 8739 – Candida albicans ATCC 10231 • L’écart entre le témoin et l’essai ne doit pas excéder 50% (0, 3 log)
Bouillon pour enrichissement : Bouillon Eugon LT 100 Contrôle des produits finis Dénombrement et détection • En plus du dénombrement , un détection est également réalisée dans un bouillon « d’enrichissement » incubé pendant 20 H. • Bouillon Eugon LT 100 Peptone pancréatique de caséine 15 g Peptonepapaïque de soja L-cystéine Chlorure de sodium Sulfite de sodium Glucose Lécithine d’oeuf Polysorbate 80 Octoxynol 9 5, 0 g 0, 7 g 4, 0 g 0, 2 g 5, 5 g 1, 0 g 5, 0 g 1, 0 g
DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILES Norme ISO 21 149 Dénombrement V m. L de diluant neutralisant Dilution d= 1/10 Validation du Dénombrement Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus à 103 UFC/m. L(masse) à 104 UFC/m. L ( surface) à 102 UFC/m. L (filtration) S (g ou m. L) de produit 1 m. L en masse 0, 1 ml en surface 10 m. L filtration 1 m. L V m. L de diluant neutralisant Dilution d= 1/10 S (g ou m. L) de produit Si inefficacité du neutralisant Témoin sans produit 1 m. L en masse 0, 1 ml en surface 10 m. L filtration Géloses TSA N Réfrigérateur T (détection des particules) 72 H ± 6 H 32, 5 °C ± 2, 5°C Validation si N >50% (0, 3 log)de T S = 1 g produit de catégorie 2 S= 5 g produit de catégorie 1
DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILES Norme ISO 21 149 Validation de la Détection Pseudomonas aeruginosa + Staphylococcus aureus V m. L de bouillon Eugon 1 m. L V m. L de bouillon Eugon à 102 UFC/m. L Dilution d= 1/10 S (g ou m. L) de produit 1 ml en masse S (g ou m. L) de produit 20 H minimum 32, 5 °C ± 2, 5°C Témoin sans produit 20 H minimum 32, 5 °C ± 2, 5°C 0, 1 ml en surface Gélose TSA 20 à 24 H 32, 5 °C ± 2, 5°C Validation si 100 à 500 UFC/m. L 48 H ± 6 H 32, 5 °C ± 2, 5°C S = 1 g produit de catégorie 2 S= 5 g produit de catégorie 1 48 H ± 6 H 32, 5 °C ± 2, 5°C Validation si présence de colonies caractéristiques Jaunes pour St. aureus Verdâtres pour Ps aeruginosa Et absence de colonie sur le témoin
Dénombrement DÉNOMBREMENT des levures et moisissures Norme ISO 16 212 Validation du Dénombrement V m. L de diluant neutralisant Dilution d= 1/10 1 m. L Candida albicans à 103 UFC/m. L(masse) à 104 UFC/m. L ( surface) à 102 UFC/m. L (filtration) S (g ou m. L) de produit V m. L de diluant neutralisant Dilution d= 1/10 S (g ou m. L) de produit Témoin sans produit 1 m. L en masse 0, 1 ml en surface 10 m. L filtration Géloses SDA Sabouraud dextrose agar N Réfrigérateur T (détection des particules) 3 à 5 jours 25 °C ± 2, 5°C Validation si N >50% (0, 3 log)de T S = 1 g produit de catégorie 2 S= 5 g produit de catégorie 1
DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES Détection Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus V m. L de bouillon Eugon Validation de la Détection 1 m. L V m. L de bouillon Eugon E. coli Dilution d= 1/10 Candida albicans Dilution d= 1/10 à 102 UFC/m. L S (g ou m. L) de produit 1 ml en masse S (g ou m. L) de produit 20 H minimum 32, 5 °C ± 2, 5°C Témoin sans produit 20 H minimum 32, 5 °C ± 2, 5°C 0, 1 ml en surface Gélose Cétrimide (ISO 21 150) Gélose Baird parker (ISO 21 718) Gélose Mac Conkey (ISO 21 148) Gélose SDA (ISO 18 416) 20 à 24 H 32, 5 °C ± 2, 5°C Validation si 100 à 500 UFC/m. L 48 H ± 6 H 32, 5 °C ± 2, 5°C 48 H ± 6 H 32, 5 °C ± 2, 5°C Validation si présence de colonie caractéristiques Et absence de colonie sur le témoin Identification S = 1 g produit de catégorie 2 S= 5 g produit de catégorie 1
DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES Souche et norme Ps. aeruginosa (ISO 21 150) St aureus (ISO 21 718) E. Coli (ISO 21 148) C. Albicans (ISO 18 416) Milieu Cétrimide Baird parker Mac Conkey SDA Colonies caractéristiques Pigment jaune-vert (pyocyanine), fluorescent sous rayonnement UV Colonies noires et brillantes, entourées d'un halo clair (de 2 mm à 5 mm) Colonie rouge brique; peut être entourée d'une zone de bile précipitée. Colonies convexes et crémeuses, de couleur blanche à beige Méthode d’identification* Gram Test enzymatique Isolement sur « Pseudomonas P » (24 à 48 H à 32, 5°C) Gram Test enzymatique Test coagulase Gram Test enzymatique Isolement sur EMB (24 à 48 H à 32, 5°C) Gram Test de filamentation Test de chlamydosporulation Résultat Bacille Gram – Oxydase + Coque Gram+ Catalase + Bacille Gram – Oxydase – Cellules ovoïdes violettes Filaments Chlamydospore Blastospore Colonies entourées d’une zone bleuverte (pyocyanine) ou rouge marron (pyorubine) Coagulase + Colonies bleu noir à reflet métallique sur EMB * Minimale : galerie biochimique ou autre méthode validée possible
Détection de micro-organismes spécifiés et non spécifiés Enrichissement (Eugon) Isolement (TSA) Gram Coque gram + Catalase + Non Kit d’identification adapté Staphylococcus aureus ? Présence de Staphylococcus aureus Non Levure autre Bacille G- oxydase + oxydase - Kit d’identification adapté Pseudomonas aeruginosa ? Escherichia coli? Présence de Pseudomonas aeruginosa Présence de Escherichia coli Kit d’identification adapté Non Présence d’un micro-organisme non spécifié Non Candida albicans? Présence de Candida albicans
Contrôle du produit fini Critères microbiologiques • Règlement (CE) n° 1223/2009, Spécifications microbiologiques de la substance ou du mélange et du produit cosmétique. Une attention particulière est accordée aux produits cosmétiques utilisés sur le contour des yeux, sur les muqueuses en général, sur une peau lésée, chez les enfants de moins de trois ans, chez les personnes âgées et chez les personnes au système immunitaire fragilisé. • BPF (ISO 22 716) Il convient que les critères d'acceptation soient établis pour spécifier les exigences auxquelles doivent répondre les matières premières, les articles de conditionnement, les produits vrac et les produits finis. • Lignes directrices du Comité Scientifique des Produits de Consommation Catégorie de produit FMAT Germes pathogènes catégorie 1* ≤ 102 UFC/ g (ou m. L) Absence dans 0, 5 g ou m. L catégorie 2 : ≤ 103 UFC/ g (ou m. L) Absence dans 0, 1 g ou m. L * destinés aux enfants < 3 ans ou en contact avec les yeux et les muqueuses recommandation du SCCP PR NF EN ISO 17516 (août 2013) Cosmétiques – Microbiologie – Limites microbiologiques
A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE. CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8. 0 2014) 5. 1. 4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des substances pour usage pharmaceutique non stériles (5. 8. ) Les critères d’acceptation de la qualité microbiologique sont interprétés ainsi : – 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20 – 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 etc…. Voie d’administration DGAT DMLT Micro-organismes spécifiés UFC/g ou /m. L Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1 g ou 1 m. L) Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1 g ou 1 m. L) Rectale 103 102 Buccale, Gingivale Cutanée, Nasale, Auriculaire 102 101 Staphylococcus aureus(1 g ou 1 m. L) Pseudomonas aeruginosa(1 g ou 1 m. L) Vaginale 102 101 Staphylococcus aureus(1 g ou 1 m. L) Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 m. L) Candida albicans (1 g ou 1 m. L) Transdermique 102 101 Staphylococcus aureus(1 dispositif) Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif) Inhalation 102 101 Staphylococcus aureus(1 g ou 1 m. L) Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 m. L) Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1 g ou 1 m. L) Absence dans ( ) Préparation à base de MP naturelle ne pouvant subir de prétraitement antimicrobien 104 102 Staphylococcus aureus(1 g ou 1 m. L) Escherichia coli (1 g ou 1 m. L) Salmonella (10 g ou 10 m. L) Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou m. L Aliments médicamenteux vétérinaire ne pouvant subir de prétraitement antimicrobien 105 104 Escherichia coli (1 g ou 1 m. L) Salmonella (10 g ou 10 m. L) Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou m. L
Contrôle du produit fini Interprétation des résultats BPF (ISO 22 716) Dossier de lot Résultats conformes ANALYSES Produit finis, vrac, MP, article de conditionnement hors spécification Enquête Retraitement Libération de lot Destruction du lot
Challenge test Risque microbiologique Règlement (CE) n° 1223/2009 • Concernant la sensibilité microbiologique, on distingue trois catégories de produits: – 1) les produits à faible risque microbiologique (par exemple, les produits dont la teneur en alcool est > 20 %, les produits à base de solvants organiques, les produits à p. H élevé/faible), pour lesquels il n’est pas nécessaire de soumettre le produit fini à un challenge test pour la conservation, ni à des contrôles microbiologiques. Une justification scientifique est toutefois requise; – 2) les produits à usage unique et les produits qui ne peuvent être ouverts (par exemple, dont le conditionnement permet de doser le produit sans que celui-ci n’entre en contact avec l’air), pour lesquels seuls des contrôles microbiologiques sur le produit fini sont nécessaires. Une justification scientifique est toutefois requise; – 3) tous les autres produits, pour lesquels un challenge test pour la conservation et des contrôles microbiologiques sur le produit fini sont nécessaires.
C) Challenge test ou test d’efficacité de la conservation antimicrobienne • • Etabli par la pharmacopée européenne ou pharmacopée US pour les médicaments et les produits cosmétiques NORME ISO 11930 : 2012 Ce test consiste en la contamination artificielle du produit cosmétique avec différents micro-organismes en nombre connu et au suivi de l’évolution de ce nombre en fonction du temps. Les souches utilisées sont celles habituellement trouvées dans les produits cosmétiques et au niveau de l’épiderme : – – – • Candida albicans Aspergillus niger Aspergillus brasiliensis ATCC 16 404 Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa 7, 14 et 28 jours La population microbienne pour chaque souche est évaluée après 2, 7, 14, 21 et 28 jours.
Challenge test 0, 2 m. L de N Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus N 0 =N/100 E. coli Candida albicans 103 102 UFC/m. L Aspergillus brasiliensis T 0 7 jours à 22, 5 °C ± 2, 5°C 1 ml en masse N 107 à 108 bactéries/m. L 106 à 107 mycètes/m. L Calcul de N Validation du neutralisant T 7 1 ml en masse 48 à Gélose TSA ou SDA Témoin inoculum 1 ml en masse 48 à 72 H à 32, 5 °C ± 2, 5°C Nvf Nx 10 ml de diluant neutralisant 1 g de produit Essai 20 g de produit Nvn Nv Validation si Nv 100 , Nvn proche de Nv et Nvf 0, 5 Nvn T 14 Nx 72 H à 32, 5 °C ± 2, 5°C 1 ml en masse 48 à 72 H à 32, 5 °C ± 2, 5°C T 28 Nx 1 ml en masse 48 à 72 H à 32, 5 °C ± 2, 5°C
Taux de réduction logarithmique (Rx = lg N 0– lg Nx) requis Micro-organismes Bactéries Temps prélèvement de C. albicans A. brasiliensis T 7 T 14 T 28 Critères A ≥ 3 et PA ≥ 1 et PA ≥ 0 ≥ 1 et PA Critères B Non réalisé ≥ 3 et PA Non ≥ 1 réalisé ≥ 1 et PA ≥ 0 et PA • critères A: la formulation est protégée contre la prolifération microbienne pouvant présenter un risque potentiel pour l’utilisateur et aucun autre facteur n’est pris en compte. • critères B: le niveau de protection est acceptable si l’analyse du risque démontre l’existence de facteurs de maîtrise non liés à la formulation indiquant que le risque microbiologique est acceptable pour le produit cosmétique. Exemple 1 crème de soin + Staphylococcus aureus Jour résultat J 0 2, 3. 10 1, 6. 1055 J 14 J 2 Exemple 2 shampoing+ Candida albicans Réduction logarithmique Red log attendue interprétation 5. 10 < 1 4 <1 5 2 � � J 28 J 7 3. 10 < 1 2 3 5 NI 3 � Conclusion J 28 Conservateur non efficace sur les mycètes < 1 5 NI � Conclusion Conservateur efficace sur Staphylococcus aureus
Liens internet Règlement 1223 : 2009 http: //eur-lex. europa. eu/Lex. Uri. Serv. do? uri=OJ: L: 2009: 342: 0059: 0209: fr: PDF DÉCISION D’EXÉCUTION DE LA COMMISSION du 25 novembre 2013 concernant les lignes directrices pour l’application de l’annexe I du règlement (CE) n° 1223/2009 du Parlement européen et du Conseil relatif aux produits cosmétiques • http: //eur-lex. europa. eu/Lex. Uri. Serv. do? uri=OJ: L: 2013: 315: 0082: 0105: FR: PDF Critères de qualité microbiologique d’un produit cosmétique http: //mon. univmontp 2. fr/claroline/backends/download. php? url=L 0 Nya. XTocm. Vz. X 21 p. Y 3 Jv. Ymlvb. G 9 na. XF 1 ZX Muc. GRm&cid. Reset=true&cid. Req=XLCH 404 Stabilité microbiologique Le contexte réglementaire et sociétal • http: //www. cosmetic-valley. com/images/1 Contexte%20 r%C 3%A 9 glementaire%20 et%20 soci%C 3%A 9 tal%20 -%20 S%20 Guyomard_1. pdf Intertek http: //www. intertek-france. com/cosmetique/analyses/microbiologie/ Normes ISO
PHARMACEUTIQUE
• Les produits pharmaceutiques sont analysés selon les directives – de la pharmacopée française et européenne pour les produits destinés à l’exploitation dans la CE – des pays de vente comme les USA (USP) ou le Japon (JP) qui disposent de leur propre pharmacopée. • Les pharmacopées distinguent deux types de produits : – Les produits qui doivent être stériles : - Les préparations pour usage parentéral (introduction d’une substance dans l’organisme par une autre voie que la voie digestive, exemple : Injection souscutanée, intraveineuse ou intra musculaire). - Les préparations ophtalmiques. - Les pansements chirurgicaux et le matériel chirurgical. - Les autres préparations devant être stérile… – Les produits non obligatoirement stériles : - Les matières premières - Les médicaments à usage non parentéral
A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE. 1 MICROORGANISMES RECHERCHÉS. • La présence de micro-organismes peut ü Réduire l’efficacité des principes actifs ü Induire des problèmes de santé • produits à faible risque de contamination : – Dénombrement de germe indicateur de la qualité globale : – les germes totaux (DGAT : dénombrement des germes aérobies totaux) – les levures et moisissures (DMLT : dénombrement des moisissures et levures totales) – Recherche des microorganismes spécifiques, pour quelques produits particuliers : E. coli , Salmonella , Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. • Leur recherche va dépendre : – – la voie et le mode d’administration La nature du produit et son aptitude à favoriser la croissance microbienne Catégorie de patients visée (YOPI) Etat du patient : Existence de blessures, lésions organiques, utilisation d’immunosuppresseurs. – Des traitements ultérieurs de fabrication pour les matières premières
CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE. 2 TECHNIQUES • Préparation de l’échantillon avec – un diluant avec neutralisant tamponné pour arrêter l’action des antimicrobiens présents (PA ou conservateur) – un tensio-actif pour mélanger les produits de nature lipidique • Méthode de dénombrement • • Filtration Dénombrement en milieu solide (produit non filtrable) • Les milieux de culture recommandés par la pharmacopée sont : – Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja pour la FMAT – Milieu Sabouraud glucosé gélosé + ATB pour les levures moisissures 2. 6. 12. Contrôle microbiologique des produits non stériles : essais de dénombrement microbien. . . . 2. 6. 13. Contrôle microbiologique des produits non stériles : recherche de microorganismes spécifies. . .
CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE. ANCIENS CRITÈRES. La limite prescrite dans la contamination microbienne dans des produits non obligatoirement stériles est 102 micro-organismes par ml ou par gramme. Limite maximale d'acceptation 5. 102 micro-organismes par m. L ou par gramme. • Si absence totale de développement, rendre < à 1 micro-organisme par ml ou par gramme. • Si développement, choisir le résultat le plus défavorable. – Si le résultat est > 102 micro-organismes par ml ou par gramme, réaliser une coloration de Gram. • si bacilles Gram +, faire une recherche de spores et pas d'identification. • si bacilles Gram-, faire une identification. • si coques Gram +, faire une identification. La conformité ou la non conformité du produit dépend du micro-organisme identifié et du traitement appliqué au produit. – Si le résultat est > 5. 102 micro-organismes par ml ou par gramme, effectuer un deuxième essai sur le même échantillon et éventuellement un troisième essai sur un échantillon différent du même lot. • • Si le deuxième essai est bon, rendre comme résultat: produit conforme; de même pour le troisième essai. Si un des deux essais terminaux est non conforme, le produit est rejeté.
A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE. 5. 1. 4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des substances pour usage pharmaceutique non stériles (5. 8. ) 3 CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8. 0 2014) Les critères d’acceptation de la qualité microbiologique sont interprétés ainsi : – 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20 – 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 etc…. Voie d’administration DGAT DMLT Micro-organismes spécifiés UFC/g ou /m. L Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1 g ou 1 m. L) Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1 g ou 1 m. L) Rectale 103 102 Buccale, Gingivale Cutanée, Nasale, Auriculaire 102 101 Staphylococcus aureus(1 g ou 1 m. L) Pseudomonas aeruginosa(1 g ou 1 m. L) Vaginale 102 101 Staphylococcus aureus(1 g ou 1 m. L) Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 m. L) Candida albicans (1 g ou 1 m. L) Transdermique 102 101 Staphylococcus aureus(1 dispositif) Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif) Inhalation 102 101 Staphylococcus aureus(1 g ou 1 m. L) Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 m. L) Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1 g ou 1 m. L) Absence dans ( ) Préparation à base de MP naturelle ne pouvant subir de prétraitement antimicrobien 104 102 Staphylococcus aureus(1 g ou 1 m. L) Escherichia coli (1 g ou 1 m. L) Salmonella (10 g ou 10 m. L) Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou m. L Aliments médicamenteux vétérinaire ne pouvant subir de prétraitement antimicrobien 105 104 Escherichia coli (1 g ou 1 m. L) Salmonella (10 g ou 10 m. L) Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou m. L
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES Médicament à analyser Incubation 1 RECHERCHE DE MICRO-ORGANISMES 30° C en – Etant des produits stériles, il ne s’agit plus de dénombrer mais de Aérobiose Bouillon TSA vérifier Bouillon Schaedler Anaérobiose – l’absence de tout microorganisme (FMAT, levures moisissures, bactéries anaérobies en bouillon thyoglycolate) Germes retenus sur les filtres – L’absence de particules – mais aussi d’endotoxine. – Vue l’absence de microorganisme dans le produit, il faut tester de grand volume d’échantillon d’où l’utilisation des techniques de filtration.
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES 1 RECHERCHE DE MICRO-ORGANISMES – Etant des produits stériles, il ne s’agit plus de dénombrer mais de vérifier l’absence de tout microorganisme (FMAT, levures moisissures, bactéries anaérobies en bouillon thyoglycolate) mais aussi d’endotoxine. – Vue l’absence de microorganisme dans le produit, il faut tester de grand volume d’échantillon d’où l’utilisation des techniques de filtration. – Afin de limiter encore le risque de contamination par l’environnement, l’appareil de filtration est manipulé sous des isolateurs : PSM de type III ou équipés d’un hémi scaphandre.
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES 2) RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE. Les normes de la pharmacopée imposent l'absence de substances pyrogènes (susceptible de provoquer une augmentation de la température) dans les produits pharmaceutiques qui entrent en contact avec la circulation sanguine ou le système nerveux central. Les pyrogènes sont soit - des micro-organismes responsables d’infections - des substances sécrétées par des micro-organismes persistant après la destruction de celui-ci ex : endotoxine
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES 2 RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE. • L'essai permettant la détection des endotoxines bactériennes est un essai in vitro réalisé à l'aide d'un réactif, le lysat d'amoebocytes de Limule (LAL), obtenu à partir des cellules circulantes de cet animal : le limule. http: //www. eprofeel. tv/v /102, charles-river-ledosage-desendotoxines. html
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES 2 - RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE. • Lors de la mise en présence du LAL et d’endotoxines, la formation de coaguline s’accompagne de l’apparition – d’un trouble (base de la méthode turbidimétrique) • Leur agrégation conduit à la formation – d’un gel (technique par gélification) • La protéine coagulogène peut être éliminée du réactif LAL et remplacée – par un substrat chromogène spécifique de la coagulase (méthodes chromogéniques) – Par un substrat fluorogene spécifique de la coagulase (méthode par fluorimétrie)
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES 2 - RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE. Un petit volume de l'échantillon (10 pi) est combiné avec le Limulus Amebocyte Lysate, et les endotoxines de l'échantillon déclenchent l'activité protéolytique du facteur C. Lorsque le substrat chromogène est ajoutée, il est catalysé par la protéase activée. le clivage produit de la p-nitroalinine (p. NA), de couleur jaune qui peut être quantifiée en mesurant l'absorbance à 405 nm (A 405) et par l'extrapolation à l'encontre d'une courbe d’étalonnage.
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES 2 DOSAGE DES PYROGÈNES « TOTAUX » .
C) CONTRÔLES QUALITÉ. • Afin de valider les contrôles sur les lots de fabrication, il est nécessaire de vérifier la conformité : - des milieux - des diluants - des produits à examiner. • Les tests réalisés sont : - des tests de stérilité des milieux et diluants: ils permettent de contrôler leur non contamination lors de leur préparation et de leur conservation en les plaçant (milieu prêt à l’emploi donc conditionné en boite et non ensemencé) à l’étuve pendant le temps et à la température d’incubation utilisés habituellement. (voir TP) - des tests de fertilité des milieux : - ils permettent de déterminer si le milieu a conservé les qualités nutritionnelles attendues au cours de sa préparation ou de sa conservation. - On ensemence le milieu avec une suspension bactérienne de référence (ATCC) de concentration connue de façon à retrouver environ 100 colonies sur le milieu. (voir TP) - L’absence de culture ou un résultat < 30 colonies traduit un problème de fertilité. - des tests permettant de vérifier l’absence d’antimicrobien dans le produit examiné. - Il consiste à mettre en contact le produit avec les souches de référence et de comparer les résultats obtenus avec un témoin réalisé sans produit. (voir TP)
• Nouveau règlement européen no 1907/2006 sur l’enregistrement, l’évaluation, l’autorisation et la restriction des produits chimiques • Entré en vigueur au 1 er juin 2007 • Tout producteur d’une substance chimique doit fournir un dossier contenant les informations physicochimiques, toxicologiques et écotoxicologiques la concernant
Liens internet • Pyrogènes • http: //www. merckmillipore. fr/chemicals/pyrodetectsystem/c_loys. Hf. ET 05 QAAAEyqp. Qqg. LUh
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