CONTRASTAO NEGATIVA Seminrio em Microscopia Eletrnica de Transmisso

CONTRASTAÇÃO NEGATIVA Seminário em Microscopia Eletrônica de Transmissão Professora Dra. Sônia Nair Báo Pedro Henrique Miranda Bürgel Raffael Júnio Araújo de Castro

CONTRASTAÇÃO NEGATIVA

HISTÓRIA E APLICAÇÕES v Surgimento – Análise de vírus • Arranjo de subunidades, caracterização de membrana, caracterização de produtos de degradação parcial, interação com anticorpos v Rapidamente difundido na microscopia eletrônica (19601980) • Simetria de proteínas oligoméricas, estudos de complexos enzimáticos, componentes musculares, ribossomos, etc. . .

RESOLUÇÃO E INTEGRIDADE v Amostras muito pequenas • Resolução com contrastação positiva é ineficaz para alta resolução (camada de resina) v Dificuldades de processamento • Amostras em suspensão (Dificuldades nas etapas anteriores) • Amostras que necessitam de integridade

DIFERENÇAS

ALTA RESOLUÇÃO E AMPLIAÇÃO • Recomenda-se o uso de lente condensadora dupla e “anticontaminador”

CONTRASTANTES v Contrastantes negativos (sais de metal pesado) • Urânio, Tungstênio ou Molibdênio • Soluções aquosas com 1 -2% v Acetato de Uranila • Uso: Vírus, bactérias, frações celulares, macromoléculas (DNA, actina, enzimas) • Contrastação positiva: afinidade por lipoproteínas • Fotossensível • Incompatível com tampão fosfato e compatível com os tampões CACO e tris • Dupla toxicidade

CONTRASTANTES v Ácido fosfotúngstico (PTA) • Uso: Vírus, bactéria, frações celulares, macromoléculas (DNA, actina, enzimas) • p. H mais neutro: bom para partículas instáveis em p. H ácido • Aditivos como SFB e albumina sérica bovina para aumentar hidrofilicidade • Compatível com tampões fosfato

CONTRASTANTES v Molibdato de amônia • Uso: membranas, subunidades de enzimas, frações celulares • Melhor resolução com detalhes extremamente finos • Contraste: acetato de uranila > MA ≈ PTA

PRÁTICA v Grid revestido (Formvar ou Colódio e/ou Carbono) - Maior estabilidade

PROCEDIMENTOS Amostra diluída

GOTA

FLUTUAÇÃO - Permite lavagens

SPRAY - Melhor adsorção - Melhor distribuição - Forma aerossóis tóxicos e/ou contaminantes - Gasta mais amostra

APLICAÇÕES BIOLÓGICAS v Acompanhamento e confirmação do isolamento e purificação de organelas, proteínas, vesículas.

ISOLAMENTO DE VESÍCULAS EXTRACELULARES Vesículas de Vibrio cholera Vesículas de C. neoformans

DEM – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DIAGNÓSTICA

DIAGNÓSTICO RÁPIDO

DESCOBERTA DE PATÓGENOS Vírus injetado Vírus recuperado do trato respiratório

Appendix. Directory of electron microscope facilities which may provide assistance and advice concerning emergency viral diagnostic matters. Sri Lanka Mohamed Abdul Azeez Razak Colombo, Sri Lanka Phone: 94 1 -693532, 1 -693533, 1 -693534, ext. 411 Fax: 94 1 -575405 e-mail: azeezrazak@hotmail. com, medresit@slt. lk France Pierre Gounon Nice, France Phone: 33 04 92 07 60 46 Fax: 33 04 92 07 60 45 e-mail: gounon@unice. fr Brazil Hermann Schatzmayr Rio de Janeiro, Brazil Phone: 55 21 598 4274 Fax: 55 21 270 6397 e-mail: Hermann@ioc. fiocruz. br Marli Ueda São Paulo, Brazil Phone: 55 11 -3068 -2908 Fax: 55 11 -3088 -3753 e-mail: marliueda@hotmail. com

BIOTERRORISMO poxvirus herpesvirus

REFERÊNCIAS v Electron Microscopy: Methods and Protocols. 3. Ed, John Kuo, Cap. 11, 2014 v Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. Vol. 2, M. A. HAYAT, Cap. 3, 1972 v Electron microscopy principles and techniques for biologists. 2ª ed. Bozzola, J. J. & Russel, L. D. Boston, Ed. Jones & Bartlett, 1992. v Técnicas de microscopia eletrônica aplicadas às ciências biológicas. 3. Ed, Wanderlley de Souza, Cap 9, 2007 v Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. M. Gentile, H. R. Gelderblom, New Microbiologica, 37, 403 -422, 2014 v Newly discovered coronavirus as the primary cause of severe acute respiratory syndrome. Kuijen et. al. THE LANCET • Published online July 22, 2003. v Electron Microscopy for Rapid Diagnosis of Infectious Agents in Emergent Situations. Paul R. Hazelton, Hans R. Gelderblom, Emerging Infectious Diseases • Vol. 9, No. 3, March 2003 v Bioterrorism and Electron Microscopic Differentiation of Poxviruses from Herpesviruses: Dos and Don’ts. S. E. Miller, Ultrastructural Pathology, 27: 133– 140, 2003