Contoh salah satu pelitian dengan penerapan metode BIOASSAY
Contoh salah satu pelitian dengan penerapan metode : BIOASSAY GUIDED ISOLATION AND STRUCTURE ELUCIDATION OF TRACHEOSPASMOLYTIC COMPOUNDS FROM Piper cubeba L. f FRUITS ISOLASI DAN PENENTUAN STRUKTUR SENYAWA TRAKEOSPASMOLITIK DARI BUAH Piper cubeba L. f
LATAR BELAKANG • MASALAH ASMA MERUPAKAN MASALAH YANG PERLU MENDAPAT PERHATIAN DI DUNIA MAUPUN DI INDONESIA. KHUSUS DI INDONESIA MASALAH YANG MENYANGKUT SESAK NAFAS INI CENDERUNG MENINGKAT. • ASMA, BATUK, SESAK NAPAS, RADANG, MUKUS KENTAL (Wrdlaw, 1993) • BUAH KEMUKUS (PIPER CUBEBA) SECARA TRADISIONAL DALAM BENTUK JAMU DIGUNAKAN OLEH MASYARAKAT UNTUK OBAT SESAK NAPAS, PENGELUARAN LENDIR PADA BRONKITIS, ANTISEPTIK PELANCAR SENI (Heyne, 1950, Dharma, 1981) • EKSTRAK N-HEXANA DAN ETANOL MEMPUNYAI KEMAMPUAN UNTUK MENGHAMBAT KONTRAKSI TRAKEA MARMUT TERISOLASI YANG DIPENGARUHI OLEH PEMBERIAN METAKOLINA (Wahyuono, dkk, 1999). OTOT POLOS TRAKEA COCOK UNTUK PENELITIAN (Hooker, 1977; Veenendal, 1986) • SPESIES PIPER LAIN MENGANDUNG SENYAWA NEOLIGNAN SEBAGAI ANTAGONIS RESEPTOR platelet activating factor(paf= SALAH SATU PENCETUS TIMBULNYA SESAK NAPAS) DIISOLASI DARI P. FUTOKADSURA (Chang dkk. , 1985) DAN PUBERELIN A, B, C DARI P. PUBERULUM (Zhang dkk. , 1995).
-KUBEBIN MERUPAKAN SENYAWA LIGNAN PERTAMA DITEMUKAN MENYUSUL KEMUDIAN DITEMUKAN LIGNAN YANG LAIN SEPERTI HINOKININ, KLUSIN, DIHIDROKUBEBIN, DIHIDROKLUSIN (Prabhu dan Mulchandani, 1985) • JAMU SPESIAL DARI INDONESIA DIBUAT DARI BEBERAPA TANAMAN, UNTUK PENCEGAHAN, PENGOBATAN, KESEGARAN MAUPUN KECANTIKAN (Beers, 2001; Sutrisno, 1996) • PEMAKAIAN JAMU DENGAN JALAN DIGODOG ATAU DITAMBAH DENGAN AIR PANAS DIMINUM (Beer, 2001) • EKSTRAK DALAM AIR MENGANDUNG SENYAWA YANG MEMBANTU MELARUTKAN SENYAWA KURANG POLAR (Samuelson, 1999) • UNTUK MENDAPAT NILAI TAMBAH JAMU DAPAT DIKEMBANGKAN MENJADI FITOFARMAKA (Pramono, 2002) • FAKTOR IKLIM, CURAH HUJAN, PENYINARAN MEMPENGARUHI KANDUNGAN SENYAWA DALAM TANMAN (Evans, 2002, Samuelsson, 1999)
PERMASALAHAN • APAKAH BUAH KEMUKUS YANG SECARA TRADISIONAL DIGUNAKAN UNTUK OBAT SESAK NAPAS DAPAT BERKHASIAT SEBAGAI TRAKEOSPASMOLITIK PADA OTOT POLOS TRAKEA MARMUT TERISOLASI. • BILA HAL TERSEBUT DAPAT DIBUKTIKAN SENYAWA APA YANG TERKANDUNG DALAM KEMUKUS YANG BERKHASIAT SEBAGAI TRAKEOSPASMOLITIK BAGAIMANA CARA EKSTRAKSI, ISOLASI , PEMURNIAN SERTA IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF TERSEBUT . APAKAH SENYAWA HASIL ISOLASI TERSEBUT BERPENGARUH SEBAGAI ANTIINFLAMASI. * # APAKAH INFUSA BUAH KEMUKUS JUGA MEMPUNYAI KHASIAT TRAKEOSPASMOLITIK APAKAH DALAM DAUN TANAMAN KEMUKUS JUGA MENGANDUNG SENYAWA BIOAKTIF SEPERTI DALAM BUAH
BAHAN DAN CARA KERJA • TRAKEOSPASMOLITIK DAN ELUSIDASI STRUKTUR • BAHAN UTAMA • • KEMUKUS DIAMBIL DARI BPTO TAWANG MANGU BUAH TUA BELUM MASAK, KERINGKAN DI OVEN TEMP. 50 C MARMOT JANTAN BERAT 300 -400 gr. ORGAN PERCOBAAN TRAKEA MARMUT SERBUK MAS. N-HEKSAN EKST. HEKSAN • ALAT DAN BAHAN KIMIA • • SEPERANGKAT ALAT OPERASI TRANSDUCER SEPERANGKAT KLT, SPEKT. IR, UV, RMI, DAN SM BAHAN KIMIA DERAJAT PROANALYSIS, KECUALI UNTUK EKSTRAKSI SISA/AMPAS KLT EKT. Et. OH. n-heksana Gab. ekst. N-HEKSANA
UJI AKTIVITAS TRAKEOSPASMOLITIK 1. PREPARASI ORGAN TRAKEA -MEMBUAT TRACHEA STRIP. OTOT POLOS DIANTARA TULANG RAWAN YANG DIPOTONG. -UJUNG ATAS DIKAITKAN DG TRANSDUCER, UJUNG BAWAH DENGAN PENGAIT. ORGAN DALAM BEJANA YANG BERISI LARUTAN KREBS, TEMP. 37 C DIALIRI GAS KARBOGEN. -EKUILIBRASI 60 MENIT SETIAP 15 MENIT LARUTAN KREBS DIGANTI SAMPAI KEADAAN STABIL
The tracheal chains of guinea-pigs • A. Trakea • B. Cincin trakea • C. Cincin dipotong • D. Cincin trakea dlm organ bath a, b, c. tulang rawan d. otot polos
PENGUKURAN KONTRAKSI TRAKEA PREPARASI ORGAN TRAKEA EKULIBRASI 60 MENIT PENGENALAN ORGAN THD AGONIS METAKOLINA (REKAM KONTRAKSINYA) PENCUCIAN ORGAN TIAP 15 MENIT (4 KALI) PEMBERIAN AGONIS METAKOLINA FAKTOR KUMULASI ½ LOG 10 (REK. KONTR) PENCUCIAN ORGAN TIAP 15 MENIT (4 KALI) PEMBERIAN EKSTRAK/SENYAWA (SAMPAI STABIL) PEMBERIAN AGONIS METAKOLINA FAKTOR KUMULASI ½ LOG 10 (REK. KONTR. )
SKEMA ISOLASI EKSTRAK N-HEKSANA KLT (DCM: Et. OCH =8: 2) VLC (PELARUT BERJENJANG) 123 4/5 6/7 8/9/10/11 12/13/14 15/16/17/18/19/20 21/22/23/24/25 -UJI AKTIVITAS/DETEKSI KLT FRAKSI AKTIF PEMURNIAN, KLT PREP ISOLAT AKTIF ELUSIDASI STRUKTUR/UJI TRAKEOSPASMOLITIK(UV, IM, RMI, SM)
Inhibition of methacholine-stimulated smooth muscle contraction on the isolated guinea-pig trachea preparation in the presence of ethanol and nhexane extract (0. 25 mg/ml)
• Fraksi 6, 7 Fraksi 8, 9, 10, 11 120. 0 120 metach. % extr. (6, 7) % extr. 8 -11 100 % response 100. 0 80 60 60. 0 7 40 40. 0 20 20. 0 0 0. 0 -8. 0 -7. 5 -7. 0 -6. 5 -6. 0 -5. 5 log dose metacholine -5. 0 -4. 5 -7. 0 -6. 5 -6. 0 -4. 0 log dose methol -5. 5 -5. 0 -4. 5 -4. 0
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 5, 5µg/ml =28, 9 ± 1, 8 % 11µg/ml = 48, 3 ± 2, 3 % 16, 5µg/ml=80, 5 ± 0, 4% KURVA PENGARUH PEMBERIAN SENYAWA I
5, 5 µg = 15, 0 ± 0, 3 % 11 µg = 29, 9± 0, 2 % 16, 5 µg= 65, 3 ± 1, 3 % • KURVA PENGARUH METAKOLINA SENYAWA II
HASIL EKSTRAKSI BERAT SERBUK = 2 kg BERAT EKSTRAK HEKSANA = 50, 17 g BERAT EKSTRAK ETANOL = 83, 13 g (LARUT DI N-HEKSAN 20, 10 g) GABUNGAN EKSTRAK N-HEKSANA = 70, 27 g HASIL PEMISAHAN DENGAN VLC ekstak n-heksana VLC Dichloromethane/ethylacetate 8: 2 v/v 1/2/3 2, 81 g not active 4/5 3, 20 g not active 6/7 1, 56 g active 8/9/10/11 7, 84 g active 12/13/14 1, 13 g not active 15/16/17/18/19/20 21/22/23/24/25 1, 69 g 5, 91 g not active ORGANOLEPTIK ISOLAT (FRAKSI 6, 7) KRISTAL BENTUK JARUM, WARNA PUTIH, TIDAK BERBAU RASA KHAS KELARUTAN : LARUT KLOROFORM, N-HEKSANA, DIKLORMETANA, SEDIKIT LARUT DI ETANOL, TIDAK LARUT DI AIR. TITIK LEBUR 133˚ C- 134˚ C
SPEKTRUM 1 H-NMR UNTUK SENYAWA I 1 DAN I 2 (CDCl 3, TMS)
SPEKTRUM 13 C-NMR (DEPT) SENYAWA I 1 DAN I 2
SPEKTRUM 1 H-1 H COSY (Expanded) SENYAWA I 1 DAN I 2
SPEKTRUM HMQC SENYAWA I 1 DAN I 2
SPEKTRUM HMBC SENYAWA I 1 DAN I 2
SPEKTRUM MASSA SENYAWA AKTIF
POLA FRAGMENTASI SENYAWA KUBEBIN
OBSERVASI HMBC KUBEBIN
SPEKTRUM 1 H-NMR UNTUK SENYAWA II (CDCl 3, TMS)
SPEKTRUM 13 C-NMR (DEPT) SENYAWA II
SPEKTRUM 1 H-1 H-COSY SENYAWA II
HMQC SENYAWA II
SPEKTRUM MASSA SENYAWA II
Cubebin 30 mg/kg b. b; dihydrocubebin 30 mg/kg bb; P. cubeba extract 1, 8 kg/kg bb; (-) control 1 % CMC; (+) control indomethacin 10 mg/kg b. b Anti-inflammatory activity of P. cubeba extracts, cubebin and dihidrocubebin on carrageenin-induced paw oedema in rats Test material Dose (mg/kg) b. w; p. o Paw volume (ml)a Inhibiti on (%) Negative control (1 % CMC-Na) Positive control (indomet hacin) Dihydroc ubebin 0. 1 ml 0. 26 0. 01 10 mg 0. 19 0. 01 30 mg 0. 26 0. 01 P. cubeba Extr. 1. 8 g 0. 18 0. 01 30 % Cubebin 30 mg 0. 15 0. 01 42 % 27 % Values, determined 3 h after carrageenin , are mean SD (n=5)
Area (dm 2), linear equation is obtained by plotting weight (ug) Y= bx + a Y= 2. 167 x + 0. 166 Cubebin yield in the month of March, June, September, December in Piper cubeba plants growing in the field. Concentration SD No Volume ug area (dm 2) No Harvest 1 0. 5 ul 0. 06 0. 20773 1 March 0. 046 0. 009 2 1 ul 0. 12 0. 491281 2 June 0. 050 0. 003 3 2 ul 0. 24 0. 7780343 3 September 0. 058 0. 010 4 Desember 0. 042 0. 005 INFUSA 0, 562 ± 0, 082 4 4 ul 0. 48 1. 199838 5 8 ul 0. 72 1. 558304 4 10 ul 0. 96 2. 345575
Total AUC, rata-rata ± SD (n=5), p<0. 005 vs kontrol, Oneway Anova
PENGARUH PENGHAMBATAN INFUSA BUAH KEMUKUS • 50µl = 46, 2 ± 0, 11 % • 100 µl = 77, 4 ± 0, 11 %
PEMBENTUKAN MDA-TBA
IC-50 of cubebin, PGVO and indomethacin No Compound a) IC-50 b) 1 Indomethacine 2. 26 2 PGV-O 9. 55 3 Cubebin 14. 61 a) Concentration of PGVO and cubebin 0. 6, 3, 15, and 30 M, indomethacin 0. 06, 0. 3, 1, 5 and 3 M b)IC-50 (50 % effective dose) was measured by using linear regression n=5 for each gradual dose
SENYAWA KUBEBIN BERSAMA EPIMERNYA
(3, 4), (3’, 4’)-bis-methylendioxy-9, 9’ dihydroxylignan or dihydrocubebin DIHYDROCUBEBIN Compound II
V. • KESIMPULAN Atas dasar hasil tersebut diatas dapat diambil suatu kesimpulan sebagai berikut : 1. Kubebin dengan epimernya merupakan lignan utama dalam buah kemukus (Piper cubeba), serta aktifitas trakeospasmolitik sesuai dengan fraksi yang kasar (crude fraction). • 2. Efek dari antiinflamasi dari kubebin menguatkan penggunaan obat tradisional dari buah kemukus sebagai antiasma dalam praktik. • 3. Infusa dari buah kemukus menunjukkan adanya efek trakeospasmolitik, serta adanya kubebin dalam infusa tersebut dapat dideteksi menggunakan metode KLT. Sehingga sangat beralasan bahwa orang minum jamu rebusan dari buah kemukus. Kubebin tidak ditemukan dalam jamu meskipun disitu tercantum keberadaan kemukus dalam formulanya, hal tersebut menyalahi aturan yang berlaku. • 4. Kadar kubebin dalam daun paling tinggi ditemukan bila dipanen pada bulan September dan mulai menurun pada bulan Desember serta mulai naik kembali pada bulan Maret dan Juni. Sehingga kemungkinan bahwa daun dapat dipakai sebagai alternatif sumber kubebin. • 5. Kubebin kemungkinan dapat dijadikan senyawa penuntun untuk pengembangan senyawa baru antiasma
The TLC chromatogram of n-hexane extract of Piper cubeba fruits • • • Method Layer (E. Merck) Mobile phase : Ascending, one dimensional development in trough with chamber saturation : Silica gel 60 F 254 : Dichloromethane/ethyl acetate ( 8 : 2 v/v) Migration : 7 cm Detection : Diluted H 2 SO 4 (50 %) 1 and 2 = n-hexane extract of Piper cubeba fruits • 3. = dihydrocubebin (Reference Standard) • 4. = cubebin (Reference Standard) • 5. = mixtures of cubebin and dihydrocubebin Reference Standard
TLC chromatogram of jamu sesak napas TLC c Method: Ascending, one dimensional development in trough with chamber saturation Layer : Silica gel 60 F 254 (E. Merck) Mobile phase : Dichloromethane/ethyl acetate ( 8 : 2 v/v) Migration : 8 cm Detection : Diluted H 2 SO 4 (50 %) A = jamu A B = jamu B C = jamu C D = jamu D E = jamu E F = jamu F G = jamu G H = jamu H X = jamu x Ext = n-hexane extract of Piper cubeba DHC = dihydrocubebin (Reference Standard) C. = cubebin (Reference Standard)
TLC chromatogram of leaves Piper cubeba L. f • • • • Method : Ascending, one dimensional development in trough with chamber saturation Layer : Silica gel 60 F 254 (E. Merck) Mobile phase : Dichloromethane/ethyl acetate ( 8 : 2 v/v) Migration : 7 cm Detection : Diluted H 2 SO 4 (50 %) 1, 6 = cubebin (Reference Standard) 2 and 3 = n-hexane extract of Piper cubeba leaves 5. = n-hexane extract of Piper cubeba fruits 7. = dihydrocubebin (Reference Standard)
- Slides: 40