CONTEXTE Groupe CIDPHARMEF 200809 CONAKRY Pr Aliou BALDE

CONTEXTE Groupe CIDPHARMEF 2008/09 CONAKRY : Pr Aliou BALDE ANGERS : Pr Olivier DUVAL

« Thématiques structurées et spécialités scientifiques » groupe « PROVASC » : Développement de molécules anti-oxydantes et/ou anti-AGEs d’origine naturelle pour la protection vasculaire. coordonné par Pierre Pacaud (UMR 915, Inserm / Université de Nantes) BUT Identifier les molécules et extraits d’origine végétale possédant des propriétés anti-oxydantes et anti-AGEs et valider leurs effets thérapeutiques sur certaines maladies

« Thématiques structurées et spécialités scientifiques » Moyens 8 laboratoires sur la région Pays de Loire > 2 M € sur 4 ans laboratoires * Biologie Neurovasculaire Intégrée (BNVI) Dir. D. Henrion * Substances d’Origine Naturelle et Analogues Structuraux (SONAS) Dir. P. Richomme

RESULTATS PRELIMINAIRES

Extraits hydroalcooliques de 4 plantes Guinéennes

Laboratoire de Biologie Neurovasculaire Intégrée (BNVI) UMR CNRS 6214 / INSERM 771 Dir. D. Henrion Membre du groupe « PROVASC » : Développement de molécules anti-oxydantes et/ou anti-AGEs d’origine naturelle pour la protection vasculaire. Test de la fonction vasculaire sur artères isolées

Myographe pour Artères de résistance Mulvany, M. J. , Halpern, W. , 1977. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation 41, 19 -27.

1 - Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales : Exemples deux substances contrôles : Tempol (SOD-mimétique) et apocynine (inhibiteur des NAD(P)H-oxydases). A W Wall force (m. N) W W U 46619 Tempol 10 -4 M B W W W U 46619 Apocynin 10 -4 M Wall force (m. N) W W

% inhibition de la contraction Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales : Les substances testées (50 µg/ml) diminuent l’action vasoconstrice du U 46619. Une partie de cette effet résulte de la stimulation de l’endothélium. SONAS 177 = Haf SONAS 178 = Haf 3 SONAS 179 = Haf 5 SONAS 180 = Per SONAS 181 = U. t. SONAS 182 = S. bowal Avec endothélium Sans endothélium

Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales: Les 6 substances testées (50 µg/ml) induisent une vasorelaxation, en partie via la stimulation de l’endothélium. % relaxation SONAS 177 = Haf SONAS 178 = Haf 3 SONAS 179 = Haf 5 SONAS 180 = Per SONAS 181 = U. t. SONAS 182 = S. bowal Avec endothélium Sans endothélium

Conclusion: Vasorelaxation en partie par un effet direct sur l’appareil contractile et en partie par stimulation de l’endothélium vasculaire. Perspectives: 1 - Eclaircir le mécanisme d’interaction avec l’appareil contractile (effet anti-oxydant et/ou autre(s) mécanisme(s)) 2 - Eclaircir le mécanisme de stimulation de l’endothélium et la voie impliquée (NO, EDHF, prostanoïdes…).

SONAS : , UPRES EA 921 Dir. Pr P. Richomme • Extractions et analyses chromatographiques : GC, CC, MPLC, CLHPDAD & CLHP-DDL, FCPC (collaboration Kromaton Technologies) • Analyses structurales : RMN 270, 300 & 500 MHz, Spectromètres de masse : Haute résolution (B/E), LC-MSn & maldi-tof

VEGEPOLYS LE CONTRAT DE PÔLE : UN LABEL ET UN ENGAGEMENT 5 axes thématiques validés par le et la Recherche ü Innovation Variétale ü Qualité Sanitaire des Semences et Plants ü Santé et Végétal ü Horticulture et Paysage Urbain üVeille et l’Intelligence Economique

VEGEPOLYS : Les Centres Techniques Valtech Centre d’Innovation et de Transfert de Technologie du Végétal Spécialisé Innovation Variétale Plante et Cité Horticulture et Paysage urbain Qualité sanitaire des semences et des plants Santé et Végétal CIET Centre d’Intelligence Economique Territorial Veille et intelligence économique dans le végétal

Balance oxydative Potentiel antioxydant de l’organisme Radicaux libres et ROS endogènes (respiration, système immunitaire…) ou exogènes (UV, radiations ionisantes, métaux…) Stress Oxydatif Enzymatique (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase…) ou non (acide ascorbique, vitamine E, flavonoïdes, Polyphénols…)

Tests Anti. Oxydant - AO Radicaux libres et ROS Tests d’activités Antioxydantes

Tests AO – ORAC (Total Oxygen Radical Absorbance Capacity) Principe : Sous l'action des radicaux libres introduits volontairement dans un milieu réactionnel, un substrat particulier* ainsi détruit perd sa capacité de fluorescence tandis que cette dernière persiste lorsqu’un (des) capteur(s) de radicaux libres est(sont) incorporé(s) dans le milieu. Objectifs : Evaluation de l’AO d’un extrait, d’un composé, d’un mélange… exprimée en équivalent Trolox** par g, par m. L (TE/g, TE/m. L) … *b-phycoerythrine, fluoresceine. (*acide hydroxy-2, 5, 7, 8 -tetramethylchroman-2 -carboxylique, analogue synthétique hydrosoluble de la vitamin E)

Tests AO - ORAC Oxydation de la fluorescéine en présence d’AAPH (Ou et al, 2001)

Tests AO - ORAC => valeur ORAC exprimée en équivalents TROLOX

Tests AO - DPPH Test DPPH • Principe : Une solution méthanolique d’un radical stable, le Di. Phényl. Picryl. Hydrazyl présente une coloration violette (lmax 517 nm) qui disparaît avec la destruction du radical. • Objectif : Evaluation de l’AO d’un extrait, d’un composé, d’un mélange… exprimée en équivalent Trolox ou comparée à celle de conservateurs utilisés dans l’industrie agroalimentaire : BHA (butylhydroxyanisole), BHT (butylhydroxytoluène)…

Tests AO - DPPH Garcinia viellardii (Clusiaceae): A. -E. HAY, M. -C. AUMOND, S. MALLET, V. DUMONTET, M. LITAUDON, D. RONDEAU and P. RICHOMME : "Antioxidant xanthones from Garcinia viellardii", J. Nat. Prod. , 67 (4), 707 -09 (2004)

Tests AO - Peroxydation lipidique Test de Peroxydation des Lipides • Principe: A partir d’un modèle « naturel » (microsomes hépatiques), dosage des peroxydes en présence ou non d’un(d’) agent(s) AO => dosage colorimétrique (532 nm) des TBARS/MDA après oxydation (Fe 2+/Vc ou AAPH) • Objectif : Evaluation du degré de protection des acides gras polyinsaturés vis à vis de la peroxydation.

Tests AO - Photochem® • Principe : Génération photochimique de radicaux libres détectés par chemiluminescence. • Objectif : évaluation automatisée du potentiel antioxydant de composés/mélanges hydro ou lipophiles. • Mesure de l’activité de la superoxyde dismutase • Inconvénient : Technique manuelle (10/j)

RESULTATS PRELIMINAIRES

Tests DPPH

Tests Anti-AGEs = D. SERAPHIN, S. DERBRE Advanced Glycated Endproducts, inhibitors and breakers ● Formation des AGEs ou réaction non-enzymatique de Maillard ► Médicaments potentiels - Complications des diabètes - Maladies neurologiques (Alzheimer…) - Maladies articulaires… ► Actifs de produits cosmétiques ou de compléments alimentaires - Vieillissement tissulaire

Tests Anti-AGEs ● Obtention de la quantité maximale d’AGEs en un minimum de temps - Plaque 96 puits ; détection : fluorescence λexc 370 nm ; λem 440 nm - Nature et concentration de la protéine : BSA 10 mg/m. L - Sucre réducteur : ribose 0, 5 M - Conditions physiologiques : 37 °C / tampon phosphate 50 m. M p. H 7, 4 - Durée de l’incubation : 24 h 1. J. A. Vinson et al. , J. Nutr. Biochem. 1996, 7, 659 -663.

Méthode de criblage des anti-AGEs ● Criblage de molécules pures - Molécule testée : gamme de concentration 10 -5 à 10 -2 M - Soustraction de la fluorescence intrinsèque de la molécule → détermination de la CI 50

Test Anti-AGEs ● Criblage de molécules pures → test efficace

Test Anti-AGEs : application au SONAS ● CI 50 52 inactifs 16 inhibiteurs 82 éch. /SONAS 12 => analyse complémentaire 2 inducteurs

Test Anti-AGEs ● Criblage d’extraits végétaux Derris ferruginea Callophyllum wallichianum Ecorces de tiges Tiges Feuilles → Problèmes de quenching

RESULTATS PERPECTIVES

RESULTATS • Résultats encourageants pour les AOs + sur vaisseaux • En attente de mise au point pour la méthode AGEs PERPECTIVES • Mise en place du projet (conventions avec Angers et autres) • Convention entre pays membre • Identification de la plante • Échanges de chercheurs • …

Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales: Application sur une artère précontractée en présence ou en absence d’endothélium. Exemple de l’acétylcholine entièrement endothélium dépendante. ACh bulles ACh Bulles: le passage de quelques bulles d’air dans la lumière de l’artère enlève l’endothélium

1. J. Peyroux M. Sternberg, Pathologie Biologie. 2006, 54, 405 -419.

Test anti-AGEs sur Extraits bruts Rinçage

Test anti-AGEs sur Extraits bruts - Développement et automatisation d’un criblage adapté aux extraits végétaux → immobilisation de l’albumine au fond des plaques 96 puits → rinçage des interférents possible Doctorat co-encadré PCDA/SONAS