Concepto de Terapia Gnica Es la introduccin de

Concepto de Terapia Génica • Es la introducción de material exógeno (natural o recombinante) en humanos para corregir deficiencias celulares expresadas en el nivel fenotípico. • Es una estrategia terapéutica basada en la modificación del repertorio genético de células somáticas mediante la administración de ácidos nucleicos y destinada a curar tanto enfermedades de origen hereditario como adquirido. • Es la transferencia de material genético nuevo a células de un individuo dando lugar a un beneficio terapéutico para el mismo.

Objetivo de la Terapia Génica • El principal objetivo de la terapia génica es erradicar o mejorar los síntomas de distintos tipos de enfermedades en las cuales no se han obtenido resultados satisfactorios aplicando terapias tradicionales. • Todas estas enfermedades podrían ser potencialmente tratadas por terapia génica, pero siguiendo diferentes estrategias: - Enfermedades Infecciosas (producidas por virus o bacterias patógenas) - Cáncer - Enfermedades Heredadas (deficiencia genética estructural de un producto génico o de sus niveles de expresión) - Enfermedades del Sistema Inmune (Alergias, inflamación y enfermedades autoinmunes)

Tipos de terapia génica Según la estirpe celular Somática Germinal Células diploides Células haploides

Ideal para enfermedades genéticas hereditarias Bioética (abuso y eugenesia) Uso en biotecnología (animales transgénicos) Largo plazo Sin consecuencias evolutivas

TRANSFERENCIA GÉNICA 1) Genes integrados al genoma humano 2) Episomas MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA • Inyección directa de ADN “desnudo” • Métodos químicos: DEAE-dextrán, precipitación con fosfato cálcico • Métodos físicos: Bombardeo de partículas, Electroporación, Sonoporación, Magnetofección, Transferencia Génica Hidrodinámica • Vectores: Virales, liposomas, polímeros

NATURALEZA DEL ENFOQUE TERAPÉUTICO 1. AUSENCIA DE EXPRESIÓN PROTEICA 2. EXPRESIÓN PROTEICA CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN 3. EXPRESIÓN PROTEICA CON GANANCIA DE FUNCIÓN A. CORRECCIÓN DIRECTA DE LA MUTACIÓN ENFERMEDADES HEREDITARIAS MONOGÉNICAS ENFERMEDADES POLIGÉNICAS NO HEREDITARIAS B. SUPLEMENTACIÓN GÉNICA C. SILENCIAMIENTO GÉNICO

NATURALEZA DEL ENFOQUE TERAPÉUTICO A. CORRECCIÓN DIRECTA DE LA MUTACIÓN B. SUPLEMENTACIÓN GÉNICA C. SILENCIAMIENTO GÉNICO - QUIMERAPLASTOS - NUCLEASAS CON DEDOS DE ZINC VECTORES (VIRALES Y NO VIRALES) ARN DE INTERFERENCIA, OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO, ARNm ANTISENTIDO, RIBOZIMAS

QUIMERAPLASTOS OLIGONUCLEÓTIDOS ARN/ADN ACTIVACIÓN DEL SISTEMA DE REPARACIÓN DE ERRORES EFICAZ EN SISTEMAS IN VITRO EN ESTUDIOS IN VIVO NO HA SIDO AÚN PROBADO

QUIMERAPLASTOS EFICAZ EN SISTEMAS IN VITRO EN ESTUDIOS IN VIVO NO HA SIDO AÚN PROBADO

NUCLEASAS CON DEDOS DE ZINC

NUCLEASAS CON DEDOS DE ZINC

VECTORES VIRALES NO VIRALES - ADENOVIRUS ASOCIADOS - RETROVIRUS - HERPESVIRUS - VACCINIA - LIPOSOMAS - POLÍMEROS

Vectores virales Ventajas • Tecnología basada en la evolución • Variedad de tropismos celulares disponibles • Frecuencia de transducción robusta • 2 tipos de virus: ADN y ARN • Genes pueden ser llevados episomalmente o integrados en el genoma Desventajas • Tecnología viral con evolución por infección y proliferación (no benigno) • Puede haber replicación de virus competentes • Riesgos de recombinación con virus salvaje in vivo • Oncogénesis • Riesgo por respuesta inmune

Adenovirus • Vector más usado • Facilidad de infectar tejidos (principalmente del sistema respiratorio) 90% seres humanos poseen anticuerpos Rápida degradación (24 hs) • No hay integración del gen en el genoma humano • Bueno para células divisibles y no divisibles • Produce altas concentraciones de proteína en células mamíferas • Administración: ex vivo o in situ • Efectos adversos: Alta inmunogenicidad

Adenovirus Inyección del nuevo gen en virus Célula humana Tratamiento exitoso: síntesis de una proteína funcional

Virus Adeno-asociados Amplio espectro de células Puede infectar células divisibles y no divisibles Infección latente Expresión a largo plazo de gen Buena relación de bioseguridad no patógenas No estimulan la respuesta inmune Se encuentran en células infectadas con adenovirus (helper) Infección productiva • Integración altamente específica (en un solo lugar) con baja frecuencia • Administración: ex vivo • • •

Virus Adeno-asociados Limitación: baja capacidad de empaquetamiento (en resolución) Fase I de terapia génica: fibrosis quística, hemofilia B Considerado para: hemofilia A, deficiencia de g antitripsina y amaurosis congénita de Leber Tratamiento para infarto del miocardio cirrosis y tumores pancreáticos o de colon

Alfavirus • Infectan células divisibles y no divisibles. • Amplio espectro de células. • No se integran al genoma humano. • Infección transitoria. • Efectos adversos: Apoptosis. IDEAL PARA LA TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER

Herpesvirus • Infectan células divisibles y no divisibles. • Tiene tropismo por las células del sistema nervioso. • No se integran al genoma humano. • Infección latente y prolongada. • Alta capacidad de empaquetamiento (20 kb) • Efectos adversos: respuesta inmune.

Herpesvirus en la terapia génica del cáncer: terapia «suicida» Gen suicida: Timidino quinasa (TK) Prodroga no tóxica: Ganciclovir

Retrovirus • Administración: ex vivo o in situ • Se integran en células divisibles • Efectos adversos: oncogénesis y respuesta inmune.

Virus Vaccinia • Infectan células divisibles y no divisibles. • No se integran al genoma humano. • Infección transitoria muy eficiente. • Efectos adversos: altamente inmunogénico.

Obtención de virus Vaccinia recombinante

RESUMEN Adenovirus -asociado Alfavirus Herpesvirus Retrovirus/ Lentivirus Virus vaccinia Adenoviridae Parvoviridae Togaviridae Herpesviridae Retroviridae Poxviridae Genoma DNA doble cadena DNA simple cadena RNA simple cadena DNA doble cadena Infección/ tropismo Células divisibles y no divisibles Células divisibles* Células divisibles y no divisibles Interacción con el genoma humano Episomal Integrado** Episomal Integrado Episomal Expresión del transgén Transitorio Puede ser prolongado Prolongado Transitorio Capacidad de empaquetamiento 7, 5 kb 4, 5 kb 7, 5 kb >30 kb 8 kb 25 kb Familia * Los lentivirus pueden también infectar células que no se dividen. ** Los adenovirus-asociados pueden integrarse en 95% de los casos a una región específica del cromosoma 19.

Virus quiméricos o seudotipos • Envoltura de los alfavirus + cápside de los retrovirus • Combina lo mejor de los dos tipos de vectores: - Infecta un amplio espectro de células (alfavirus) - El transgén puede ser integrado al genoma humano (retrovirus)

Vectores no virales Ventajas • Pueden infectar cualquier tipo celular. • No son tóxicos (en general). • No generan efectos adversos. • No tienen un límite máximo de ADN a transportar. Desventajas • Ingreso en la célula poco eficiente. • Sólo para terapias ex vivo. • No se integran al genoma humano.

Vectores no virales LIPOSOMAS POLÍMEROS

SILENCIAMIENTO GÉNICO POST-TRANSCRIPCIONAL

Oligonucleótidos Antisentido • Se une a pre-m. RNA o m. RNA • Interfiere en el procesamiento (splicing, poliadenilación, exportación, estabilidad) y en la traducción del RNAm • Down-regulation: clivaje del ARNm por una RNAsa H o impide la traducción. • Up-regulation: Por manipulación del sitio de splicing • Desventaja La presencia de estructuras secundarias en el ARN que impide que se una el oligonucleótido antisentido. Se requieren pruebas previas para buscar regiones simple cadena. • Efecto adverso Off-targeting • 1. 2. 3. 4. ESTRATEGIA Diseño del oligonucleótido antisentidos Producción de la molécula por síntesis química Incorporación a la célular blanco por liposomas o electroporación Nueva generación de oligonucleótidos con modificaciones químicas que los hacen más estables.

Oligonucleótidos Antisentido DOWN-REGULATION

Oligonucleótidos Antisentido UP-REGULATION Restauración del sitio de splicing

Ribozimas Pequeñas moléculas de RNA con actividad de endonucleasas Catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiéster específicos Fragmentos largos o cortos: Largos intrones del GII o GI Cortos hammerheads (40 nt) Debe conocerse la secuencia previamente Iguales problemas que los oligos antisentidos Ingresan mediante plásmidos o administrados exógenamente Hammerheads sintéticos son más estables

Ribozimas

RNA de interferencia - Sistema descubierto en la década de 1990 s en plantas y animales inferiores como mecanismo de regulación de la expresión génica. - Debido a su gran capacidad inhibitoria de la expresión de proteínas, esta tecnología es empleada en la terapia génica.

ds. RNA si. RNA RESUMEN DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS si. RNAs Y mi. RNAs EN LA NATURALEZA

RESUMEN DEL MECANISMO DE ACCIÓN DEL ARN DE INTERFERENCIA EN LA NATURALEZA

RNA de interferencia ESTRATEGIA • Diseño de si. RNA (secuencias de nucelótidos probables) • Producción de la molécula de si. RNA: a. Síntesis química b. Transcripción in vitro c. Clonado • Incorporación a la célula blanco por: a. Microinyección b. Absorción c. Inoculación d. Bombardeo e. Electroporación f. Vectores virales • Nueva generación de si. RNA con modificaciones que los hacen más estables (sh. RNA)

Diseño de un si. RNA sintético

OLIGONUCLEÓTIDO ANTISENTIDO vs. RNAi Oligonucleótido antisentido RNA de interferencia Efecto transitorio y regulable, por esto es más fisiológico que el knock down de genes Sistema eficaz y potente Similares niveles de reducción de RNAm y proteínas Off targeting (silenciamiento de un RNAm no deseado) Up o down regulation Down regulation Incorporación a la célula blanco: limitada por liposomas o electroporación Incorporación a la célula blanco: más uniforme por vectores virales 1/20 molécula efectiva/testeadas 1/2 a 1/4 molécula efectiva/testeadas Más barato Más caro No induce IFN Puede inducir IFN

SILENCIAMIENTO GÉNICO POST-TRADUCCIONAL ADN o ARN simple cadena con afinidad a una proteína o flia. de proteínas para inihibir su función

Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX)

¿Cuáles son los puntos para lograr una terapia génica exitosa? v TARGETING La terapia actúe sobre la célula blanco (y no otra) v ACTIVAR el gen transferido v INTEGRAR el gen transferido al genoma de las células blanco (para tener un efecto más duradero) v EVITAR efectos adversos dañinos