Comparative Proteomic Analysis of Extracellular Proteins Reveals Secretion

Comparative Proteomic Analysis of Extracellular Proteins Reveals Secretion of T-Kininogen from Vascular Smooth Muscle Cells in Response to Incubation with S-Enantiomer of Propanolol Jianjun Sui, Jianhua Zhang, Chi Bun Ching and Wei Ning Chen

Proteómica o o La proteómica comprende todas las proteínas presentes en un organismo, tejido o célula en particular en un momento determinado. En contraste con la genómica, la proteómica no es estática. Las diferencias en la expresión de proteínas no son accesibles a nivel genómico, pero si a nivel proteómico.

o La información cuantitativa de las proteínas expresadas es necesaria y constituye un paso clave para entender por completo la función de las organelas, células, organismos; así como también los procesos de enfermedad.

o - - La técnica de la proteómica puede resumirse en cuatro pasos fundamentales: Aislamiento de la proteína y preparación Separación de la proteína (HPLC, 1 D gel electrophoresis, etc) MS Software bioinformático

Introducción o o Los receptores β adrenérgicos pertenecen a una familia de receptores acoplados a proteína G. Existen 3 tipos conocidos de β adrenoreceptores (β 1, β 2, β 3) β 1 Corazón y riñones β 2 Pulmones, tracto gastrointestinal, vasculatura y útero.

Receptor β 2 -Adrenérgico o Structure of the β 2 adrenergic receptor. The receptor protein is colored as a rainbow from blue at one end (N-terminus) to red at the other (Cterminus). In a cell, the long helices at the core of the molecule cross the cell membrane.

Propanolol R- Propanolol S-Propanolol

o o Es un β bloqueador no selectivo, que bloquea la acción de la epinefrina en ambos adrenoreceptores. Β-bloqueadores inhiben las acciones de los mediadores de epinefrina reduciendo el efecto en la tasa de excitación y fuerza de contracción miocárdica, dilatación de vasos sanguíneos y apertura de bronquios.

o o El propanolol es utilizado en arritmias ventriculares asociadas a cardiopatía isquémica, reduciendo la actividad arritmogénica en pacientes con infarto de miocardio previo. T-Kininógeno metabolitos activos (Kininas): BK B 1 y B 2 o B 2 protección contra isquemia

Objetivo o Investigar la secreción de proteínas con diferentes niveles de expresión en medios de cultivo de células de tejido vascular liso (A 7 r 5) incubadas por separado con los enantiómeros individuales del Propanolol usando el método de cuantificación i. TRAQ acoplado con LC-MS/MS bidimensional.

Justificación o o β bloqueadores se administran como mezclas racémicas, aunque solo el enantiómero S tiene actividad sobre el receptor. β bloqueadores potenciales efectos adversos a dosis usuales.

Hipótesis o El enantiómero S del propanolol provoca una mayor secreción protéica en las células de músculo liso vascular con respecto al enantiómero R.

Sección Experimental o o Se utilizó una estrategia que simultáneamente detecta y cuantifica diferencias en la secreción de proteínas en células de músculo liso vascular. Para esto se seleccionó un grupo de células (A 7 r 5): Control Enantiómero S Enantiómero R

Condiciones del cultivo celular o o o Células a 37ºC en atmósfera de 5% de CO 2 Luego de alcanzar el 80% de la expansión celular, se incubaron con el enantiómero R y S del propanolol (20 M). Luego de 24 h, el medio de cultivo fue removido, filtrado y concentrado para su posterior análisis.

Tratamiento de muestras: o Se etiquetaron las proteínas secretadas de cada medio de cultivo con los reactivos i. TRAQ Control A 7 r 5 = i. TRAQ 114 Enantiómero S = i. TRAQ 115 Enantiomero R = i. TRAQ 117 o Separación de proteínas mediante CL

o Fragmentación e identificación de proteínas por MS Criterio: 2 o más péptidos deben ser identificados con un alto grado de confianza (>95%) o Cuantificación con método Western Blot

Reactivos i. TRAQ

Resultados

Figura 1: Espectro de masas T-Kininógeno

Análisis i. TRAQ

Análisis Western-Blot

Discusión o o o Células tratadas con el enantiómero S generaron mayor producción de T-Kininógeno cuantificado péptidos de quinina vasoactivos bradiquinina: respuesta mediada por B 1 y B 2: expresado en la mayoría de tejidos, protege contra la isquemia por disfunción cardiaca

o En este artículo, por medio del análisis i. TRAQ acoplado a 2 D-LC/MS/MS y el análisis de Western Blot se logró demostrar por primera vez que las células A 7 r 5 pueden secretar T-Kininógeno.

En Conclusión o o La aplicación de la proteómica cuantitativa provee un acercamiento efectivo para entender el mecanismo de acción del propanolol y aclara los roles de las proteínas (etiquetadas) durante la enfermedad. Es posible asociar el uso de propanolol en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares a través del T-Kininógeno.

Bibliografía o o o Boehm A et all: Precise protein quantification based on peptide quantification using i. TRAQ™. BMC Bioinformatics 2007, 8: 1 -18. Ross L et all: Multiplex Protein Quantitation in Saccharomyces cerevusiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Molecular & Cellular Proteomics 2004, 3: 1154 -1169. Hansen K et all: Mass Spectrometric Analysis of Protein Mixture at Low Levels Using Cleavable 13 C-Isotope-coded Affinity Tag and Multidimensional Chromatography. Molecular & Cellular Proteomics 2003, 2: 299 -314.

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