Cng ngh sinh hc dc PHN 1 i

Công nghệ sinh học dược

PHẦN 1 Đại cương

Công nghệ sinh học Các kỹ thuật sử dụng các hệ thống sống để tạo ra sản phẩm l Truyền thống: Có từ rất lâu, Dựa trên kinh nghiệm, vi sinh vật học l l l Công nghệ lên men Hiện đại: Nửa sau thế kỷ 20, dựa trên sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh, … l l l Công nghệ gen Công nghệ enzym-protein Công nghệ tế bào

Các giai đoạn phát triển l Thế hệ một: sản xuất các sản phẩm thực phẩm và nước uống lên men. Kỹ thuật được sử dụng bao gồm lên men, nuôi trồng và nuôi cấy mô thực vật. l Thế hệ hai: sử dụng nuôi cấy tế bào hay nuôi cấy mô để sản xuất. Sản phẩm của thế hệ này gồm kháng sinh, enzym, vitamin, acid amin. Kỹ thuật được sử dụng bao gồm đột biến và chọn lọc chủng vi sinh vật và phương pháp lên men, nuôi cấy để sinh sản phẩm tối ưu. l Thế hệ ba chính là CNSH hiện đại. Nó bao gồm các kỹ thuật tái tổ hợp di truyền. Ứng dụng công nghiệp của nó bao gồm dược phẩm, nông nghiệp, hóa chất, y học. Các sản phẩm hiện nay đang là các protein trị liệu, chẩn đoán, vaccin và cải tạo giống nông nghiệp.

Sự mở rộng nguồn gen l Công nghệ cổ điển tạo giống hay tính trạng mới dựa vào lai tạo, đột biến-sàng lọc: l l l Giới hạn trong phạm vi loài và lân cận Mất thời gian, hiệu suất không cao Công nghệ hiện đại thao tác trên gen: l l Cải tạo ở mức phân tử, dưới loài Không còn giới hạn loài Nhanh và hiệu quả Nguồn gen vô tận

Phạm vi ứng dụng Công nghệ sinh học xanh (Green Biotechnology): CNSH áp dụng trong nông nghiệp và xử lý môi trường. l Công nghệ sinh học trắng (White Biotechnology): Sử dụng xúc tác sinh học và công nghệ lên men để tạo ra các sản phẩm công nghiệp như hóa chất hay enzym. l Công nghệ sinh học đỏ (Red Biotechnology): CNSH ứng dụng trong y tế. Chẩn đoán và điều trị bệnh. Sản xuất dược phẩm. l

Các đặc điểm của CNSH Đa năng l Đòi hỏi mức độ nghiên cứu cao l Đa lĩnh vực l Có tính hợp tác cao l

Đặc điểm của CNSHYD Đòi hỏi mức độ đầu tư cho nghiên cứu cao l Qui mô vừa và nhỏ l Tỷ lệ đầu tư nghiên cứu cao hơn sản xuất l Có tính phối hợp cao l

Sản phẩm của CNSHYD l Chẩn đoán y học l l l Dự phòng bệnh l l l Vaccin Thực phẩm chức năng Điều trị bệnh l l Sản xuất sinh phẩm chẩn đoán Kỹ thuật chẩn đoán mới Liệu pháp gen Liệu pháp tế bào Huyết thanh, kháng thể Sản xuất dược phẩm l l Dược phẩm tái tổ hợp Thuốc có nguồn gốc sinh vật Sản xuất thuốc bằng xúc tác sinh học Nuôi cấy mô, tế bào

Các vấn đề của CNSH trong nước l l l Thiếu qui hoạch. Qui hoạch sai. Đầu tư thấp. Yếu kém trong phát triển nguồn nhân lực. Bất hợp lý trong quản trị nhân lực. Thiếu sự liên kết giữa cơ sở nghiên cứu và sản xuất. Chưa có cơ sở hạ tầng công nghiệp thích hợp.

PHẦN 2 Công nghệ lên men

Công nghệ lên men Định nghĩa: quá trình biến đổi do vi sinh vật thực hiện trong điều kiện yếm khí hay hiếu khí l Sản phẩm l l l Sinh khối vi sinh vật Enzym – protein vi sinh vật Sản phẩm trao đổi chất: sơ cấp + thứ cấp Các biopolymer và biosurfactant Sản phẩm tái tổ hợp gen

Chu ng vi sinh vâ t 1: Không gây bệnh cho người, động vật và môi trường (GRAS - Generally Recognized As Safe) 2: Có thể gây khó chịu cho người, động vật và môi trường 3: Gây bệnh, truyền bệnh nhưng có cách chữa trị 4: Gây bệnh, truyền bệnh rất nhanh nhưng chưa có cách chữa trị

Thu nhận chủng l Phân lập từ môi trường l l l “săn lùng” (shotgun) có định hướng (objective) Ngân hàng chủng l l Nhanh, ít tốn kém Không có tính cạnh tranh

Yêu cầu của chủng công nghệ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Ổn định di truyền Sản xuất hiệu quả sản phẩm mong muốn, và con đường sinh tổng hợp sản phẩm đã được khảo sát kỹ Không cần hay ít cần các bổ sung vitamin và yếu tố tăng trưởng Sử dụng được các cơ chất phổ biến và rẻ tiền Có thể biến đổi di truyền được An toàn, không gây bệnh, và không sản xuất chất độc, trừ khi đó chính là sản phẩm Dễ dàng thu hoạch từ quá trình lên men Dễ dàng phá vỡ tế bào nếu sản phẩm là nội bào Ít tạo ra sản phẩm phụ để thuận tiện cho việc tinh chế sản phẩm

Cải tạo chủng Tái tổ hợp tự nhiên l Gây đột biến l l l Đột biến ngẫu nhiên Đột biến nhân tạo - cảm ứng l l Sử dụng base tương đồng Thay đổi về hóa học của các base Chiếu xạ Gây đột biến bằng transposon Lai ghép tế bào trần và biến nạp gen l Thao tác di truyền trên vi sinh vật l

Chiến lược thao tác di truyền l l l Sàng lọc gen từ tế bào nguồn Cô lập gen quan tâm: tạo dòng Thực hiện các biến đổi cần thiết Đưa gen trở lại tế bào đích Kiểm tra và sàng lọc chủng mới

Sàng lọc thể đột biến l l l l Kiểu hình quan sát được Khuyết dưỡng: cấy trên môi trường tối thiểu Tổng hợp gây chết Kháng chất chuyển hóa Khóm vệ tinh Quang ứng động, hóa ứng động Khác biệt tỷ trọng: ly tâm phân đoạn

Làm giàu thể khuyết dưỡng bằng penicillin

Bảo quản giống vi sinh vật l Ngân hàng tế bào l l Ngân hàng gốc (master cell bank) Ngân hàng làm việc (working cell bank) Cấy chuyền l Làm khô l Đông lạnh l

Môi trường lên men l Cung cấp chất dinh dưỡng để tế bào phát triển l l l Chất dinh dưỡng Yếu tố tăng trưởng Cung cấp các chất cần thiết để thu sản phẩm l l Sinh khối Chất chuyển hóa sơ cấp Chất chuyển hóa thứ cấp Chất cảm ứng

Các loại môi trường lên men Môi trường tổng hợp: đó là môi trường có thành phần hóa học chính xác về mặt định tính và định lượng. l Môi trường phức hoặc bán tổng hợp: người ta chỉ biết thành phần chính xác của một vài hợp chất (về mặt định lượng đối với các chất cần quan tâm như yếu tố tăng trưởng, các thành phần khác dựa theo kinh nghiệm). l Môi trường công nghiệp: nguyên liệu phức ban đầu chủ yếu bắt nguồn từ các sản phẩm nông nghiệp hoặc từ sữa vì chúng rẻ và tương đối dồi dào. l

Tiêu chí chọn thành phần môi trường l l l l Giá thành và khả năng cung cấp. Dễ xử lý, vận chuyển, và bảo quản với chi phí thấp. Không gây khó khăn cho quá trình tiệt trùng và không bị biến chất. Có các thuộc tính vật lý như độ nhớt, khả năng trộn lẫn, … không ảnh hưởng đến công thức chung, việc vận hành nồi cũng như xứ lý sau lên men. Giúp đạt được nồng độ sản phẩm đích với tốc độ hình thành và năng suất sản phẩm trên gam cơ chất cao. Nồng độ và loại tạp chất cũng như khả năng tạo sản phẩm phụ thấp không làm ảnh hưởng đến quá trình tách sản phẩm chính sau đó Có tính an toàn tốt

Nguồn carbon l l l l l Ycarbon (g/g) = Sinh khối tạo ra (g) / Nguồn carbon sử dụng (g) Mật mía Cao chiết mạch nha Tinh bột và dextrin Nước thải sulfit Cellulose Bã sữa chua Alkane và alcol Chất béo và dầu

Nguồn nitơ Nước thải ngâm bắp l Cao nấm men l Peptone l Bã đậu nành l

Các thành phần khác l l l l l Nước Khoáng chất Vitamin và yếu tố tăng trưởng Các tiền chất Các chất cảm ứng và kích thích Các chất ức chế Chất thay đổi tính thấm tế bào Oxi Chất chống bọt

Biện pháp kiểm soát bọt Thay đổi công thức môi trường l Phá bọt cơ học l Các chất phá bọt: thường là các chất hoạt động bề mặt: l l l l Nhanh chóng phân tán và tác động nhanh Tác động mạnh với liều thấp Có tác động kéo dài Không độc đối với vi sinh vật lên men, người hay thú Giá rẻ Bền nhiệt Tương thích với các thành phần môi trường và qui trình

Hệ thống lên men Cảm biến p. H, nhiệt độ, oxi, bọt, mức l Cung cấp oxi, chất dinh dưỡng, chất kiểm soát p. H, l Cánh khuấy l Cổng thu hoạch l

Các thiết bị nuôi cấy khác

Các phương thức lên men l Kiểu vận hành l l Độ kín của hệ thống l l l Lên men hở Lên men vô trùng Sự thông khí l l l Lên men gián đoạn Lên men bổ sung dinh dưỡng gián đoạn Lên men liên tục Lên men hiếu khí Lên men kỵ khí Kiểu thiết bị sử dụng l l Lên men nổi Lên men chìm

Lên men bề mặt

Lên men chìm

Giám sát quá trình lên men Các cảm biến in situ l Các bộ phân tích trực tuyến l l l flow injection analysis sequential injection analysis khối phổ (mass spectrometry - MS) lỏng hiệu năng cao (HPLC) sắc ký khí (GC)

PHẦN 3 Sản xuất kháng sinh

Mở đầu Hiện đã biết > 10 000 kháng sinh nhưng chỉ 200 được sản xuất và sử dụng thương mại l Việc tìm kiếm kháng sinh mới luôn tiếp diễn, quá trình R&D của 1 KS mới có thể mất 15 năm l Sản xuất kháng sinh l l Sinh tổng hợp - Lên men l l l Bán tổng hợp l l Penicillin (V, G), Cephalosporin C Macrolid, Aminosid, Tetracyclin, … Các Beta-lamtam khác Tổng hợp hóa học l l Sulfamid Quinolone

Sản xuất penicillin l Giống l Penicillium notatum: do Fleming phân lập 1928, Florey l và Chain xác định cấu trúc 1940 Penicillium chrysogenum: hiệu suất cao hơn, được cải tiến thành chủng công nghiệp ngày nay l l l Tốc độ tạo sản phẩm và hiệu suất cao Nuôi cấy chìm Sử dụng được cơ chất phức tạp và tiêu thụ tốt phenylacetat. Không tạo sắc tố gây khó khăn cho việc tinh chế. Có hệ sợi sinh trưởng rắn chắc.

Nhân giống Thu lượng giống tinh khiết cần thiết ở pha tăng trưởng lũy thừa (logarit) cho giai đoạn lên men l Tiêu chuẩn l l l giống không nhiễm mật độ tế bào đạt yêu cầu

Môi trường lên men l Nguồn nitơ: nước thải ngâm bắp l l Bổ sung thêm giữa chừng: amoniac Nguồn carbon: glucose, sucrose và các dịch đường thô, l l 65% để duy trì tế bào, 20– 25% để tăng trưởng và 10– 12% cho sản xuất penicillin Trước đây: Lactose Canxi, magiê, phosphat, và các kim loại vi lượng l Tiền chất: l l l acid phenylacetic (G) acid phenoxyacetic (V)

Lên men Nồi lên men: thùng khuấy 25 -250 m 3 l Oxi: 0, 5 - 1, 2 vvm nhờ máy nén khí l Nhiệt độ: 26 1 o. C, cần thiết bị làm mát l Chế độ vận hành l l l Gián đoạn bổ sung dinh dưỡng, thu hoạch từng phần Thời gian: 120 -200 giờ l Kiểm soát l l l Nhiệt độ Oxi Cân bằng nitơ/carbon p. H Kết thúc: l l khi giảm hiệu suất chuyển đổi glucose penicillin hiệu suất: 40 g/L

Lên men Đường Penicillin

Hậu lên men Loại tế bào: lọc/ly tâm l Chiết penicillin l l l p. H: 2 -2, 5, dung môi: amyl acetate, butyl acetate và methyl isobutyl ketone Chiết lại ở p. H 7, 5, dung môi: nước Loại sắc tố: than hoạt Kết tinh l l Thêm muối thích hợp (kali acetat) Tẩy màu lại và rửa bằng dung môi để tăng độ tinh khiết Hiệu suất thu hồi: >90% l Giá thành: ~10 USD/kg l

Tóm tắt qui trình

Sinh tổng hợp cephalosporin C Expandase Penicillin N Deacetoxycephalosporin C Hydroxylase Acetyltransferase Cephalosporin C Deacetylcephalosporin C

Lên men cephalosporin C Lên men bổ sung dinh dưỡng gián đoạn A. chrysogenum. l p. H 6. 0 - 7. 0, nhiệt độ 24 - 28 o. C. l Môi trường: l l Nguồn carbon: l l l l Nguồn nitơ: bột đậu nành, hạt bông có bổ sung amonium sulfate. Ammoniac có thể dùng để kiểm soát p. H Nước ngâm bắp hay dùng làm nguồn nitơ và khoáng chất, vitamin. DL-Methionine: cảm ứng hình thành bào tử đốt Thông khí: l l Glucose giúp tăng trưởng nhanh nhưng giảm năng suất. Chỉ cung cấp vào giai đoạn đầu. Galactose và sucrose: tăng trưởng chậm, năng suất cao hơn Thay dần đường bằng dầu đậu nành hay đậu phọng: giảm glucose, giúp hình thành bào tử đốt và cephalosporin C. Dầu có tác dụng chống bọt Cyclase và expandase cần oxi để xúc tác: nếu oxi hòa tan giảm <20% penicillin N sẽ tích tụ và hiệu suất cephalosporin C sẽ giảm Thêm acetyl esterase (Rhodosporidium toruloides): tích tụ deacetylcephalosporin C (bền) tăng năng suất

Thu hồi cephalosporin C l Dùng cột than hoạt / cột nhựa không ion l l l cephalosporin C được hấp phụ chọn lọc so với penicillin N, deacetylcephalosporin C, and deacetoxycephalosporin C Đánh bóng bằng sắc ký trao đổi anion Tạo dẫn xuất tetrabromocarboxybenzoyl cephalosporin C l l Kết tinh từ dịch nước acid / tạo muối với base hữu cơ+chiết tách bằng dung môi Thích hợp thu hồi làm nguyên liệu bán tổng hợp

Sản xuất các beta-lactam khác l Cephalosporin C, cephamycin C và penicillin được dùng để sản xuất các khung cho việc bán tổng hợp các beta-lactam khác 6 -APA

Sản xuất các khung để bán tổng hợp l 6 -APA: thủy phân Penicillin l l 7 -ADCA: là tiền thân của 1/3 cephalosporin l l l Hóa học: chiếm ưu thế từ 1970, nhưng hiện gặp nhiều vấn đề về môi trường, dung môi và tốn năng lượng Enzym: được sử dụng từ 1960, nhưng ngưng do giá thành và vấn đề tái sử dụng. Đến 1990 enzym cố định giải quyết được vấn đề E. coli tái tổ hợp để sản xuất penicillin G acylase và Fusarium oxysporum tái tổ hợp sản xuất penicillin V acylase 7 -ADCA được sản xuất từ penicillin G bằng phản ứng mở rộng vòng. Merck và Panlabs: dùng P. chrysogenum mang gen cef. E (expandase) của S. clavuligerus. Khi cung cấp disodium adipate, nó sản xuất adipoyl 6 -APA, rồi được chuyển thành adipoyl 7 -ADCA nhờ expandase tái tổ hợp. Mạch adipoyl được cắt nhờ adipoyl acylase của Pseudomonas thành 7 -ADCA. 7 -ACA: là tiền thân của 2/3 cephalosporin l được sản xuất từ cephalosporin C bằng phản ứng deacyl hóa nhờ enzym hay hóa học

Các thế hệ Cephalosporin I (cephalothin, cephaloridine, and cefazoline): biến đổi vị trí C-3 và C-7 của 7 -ACA l II: kháng β-lactamase l l III: kháng β-lactamase + phổ rộng: l l Cephamycin C mang nhóm 3 -carbamoyl và 7 -methoxy kháng β-lactamase: cefoxitin and moxalactam 7 -oximinoacyl cephalosporin: cefuroxime thêm nhóm aminothiazole thân nước vào oximinocephalosporin (thế hệ II): cefotaxime, ceftizoxime, và ceftazidime IV (cefepime và cefpirome): có vòng aminothiazole ở C -7 cùng với nhóm thế oxyimino và nitơ bậc IV ở C-3

Sản xuất erythromycin l Chủng: Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus ) l l Năng suất cao: 8 -10 g/L Ít sản phẩm phụ: > 90% Ery A

PHẦN 4 Sản xuất acid amin

Phương pháp sản xuất acid amin Phương pháp trích ly các acid amin từ dịch thủy phân protein. Phương pháp này dùng để thu nhận L -cystein, L-cystin, L-leucin, L-asparagin, L-tyrosin l Phương pháp tổng hợp hóa học. Phương pháp này dùng để sản xuất glycin, alanin, methionin, tryptophan l Phương pháp lên men vi sinh vật l

Phương pháp lên men vi sinh vật l l l Phương pháp sử dụng các chủng vi khuẩn hoang dại (Lglutamic acid, L-alanine, L-valine) Phương pháp sử dụng vi khuẩn đột biến (L–lysine, L– threonine, L–arginine, L– citrulline, L–ornithine, L–homoserine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-histidine, …) Phương pháp thêm các tiền chất ( L-throenine, L-isoleucine, Ltryptophan…) Phương pháp enzym (L-aspartic acid, L-alanine, L-cyteine, Ldihydroxyphenylalanine, D-p-hydroxyphenyl-glycine…) Phương pháp sử dụng các dòng vi khuần được tạo ra bằng các kỹ thuật biến đổi gene, protein và chất chuyển hóa hoặc sự kết hợp của các kỹ thuật trên (hydroxy-L-proline)

L-Glutamic acid - điều kiện sản xuất l l l Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum Môi trường có nồng độ đường và các ion aminonium cao, nồng độ khoáng chất thích hợp Nồng độ biotin giới hạn hoặc bổ sung penicllin hoặc xà phòng Điều kiện hiếu khí Năng suất L-glutamate: khoảng 100 g/L /2 -3 ngày

L-Glutamic acid - điều kiện sản xuất l l l Chủng vi khuẩn: Corynebacterium , cần biotin Nguồn carbon: glucose, thủy phân tinh bột Nguồn nitơ: cao, ammoniac Cơ chế: glutamate dehydrogenase amin hóa 2 -oxoglutarate (Chu trình Krebs) thành glutamate Vai trò biotin (hoặc penicillin, xà phòng): làm rò rỉ Công nghệ gen: l l Đột biến mất gen mã hóa 2 -oxoglutamate dehydrogenase sản xuất glutamate Đột biến mất gen dts. R sản xuất glutamate

L-Glutamic acid - ứng dụng l l l Monosodium L-glutamate: triệu tấn/năm Làm bột ngọt, chất điều vị Xà phòng, da nhân tạo Phụ gia đông khô Dược lý: l l l Chất dẫn truyền thần kinh Glutamine: Điều hòa sự tăng trưởng và chức năng tế bào: cùng với hormon tăng trưởng để điều trị bệnh ruột ngắn (short bowel syndrome) Rút ngắn thời gian hậu phẫu ruột Acid amin không thiết yếu Quá liều: nhức đầu, hội chứng “nhà hàng Trung Hoa”

L-Lysine Chủng vi khuẩn: Corynebacterium glutamicum, l Môi trường có nồng độ đường, ion ammonium cao, p. H trung tính l Điều kiện hiếu khí l

L-Lysine - Chủng l l l Đột biến tự dưỡng homoserine (hoặc threonine cộng với methionine), thiếu enzym homoserine dehydrogenase Kiểu hình nhạy cảm với threonin hay methionin Đột biến đề kháng chất tương tự lysine Aspartokinase không nhạy cảm với ức chế ngược Đột biến cần leucine Công nghệ gen: tạo dòng và giải trình tự các gen liên quan l l l Gen ldc (mã hóa lysine decarboxylase - phá hủy lysine) Gen cad. A (mã hóa chất cảm ứng ldc) Gen lys. E (mã hóa chất vận chuyển lysine ra khỏi tế bào)

L-Lysine - Ứng dụng Lysine được dùng làm chất bổ sung cho thức ăn gia cầm, heo vì các thức ăn thường dùng như ngũ cốc, đậu nành không béo chứa ít lysine, là một acid amin thiết yếu cho vật nuôi. l Lượng L-lysine được sản xuất trên thế giới hàng năm khoảng 400. 000 tấn l Dược lý: l l Acid amin thiết yếu Dự phòng và điều trị Herpes simplex Hỗ trợ điều trị ung thư (đang nghiên cứu)

L-Threonine l Chủng: l đột biến dị dưỡng L-lysin, diaminopimelate, hay L-methionin l và/hay đột biến đề kháng chất tương tự threonin l các chủng được tạo ra bằng công nghệ gen

L-Threonin - Công nghệ gen l S. marcescen đột biến bằng giới nạp với phage l l l khiếm khuyết enzym thoái hóa L-threonin đột biến trên aspartokinase và homoserine dehydrogenase làm mất nhạy cảm với quá trình ức chế ngược của L-threonin đột biến ở các enzym sinh tổng hợp L-threonin làm cho chúng không bị ức chế bởi L-threonin đột biến trên aspartokinase làm mất nhạy cảm với sự ức chế ngược bởi L-lysin đột biến ở aspartokinase và homoserine dehydrogenase làm cho chúng không bị ức chế bởi Lmethionine

Sản lượng L-threonin của các chủng vi khuẩn đột biến Thời gian (h) Lượng (g/l) Tốc độ (g/l/h) C. glutamicum 90 52 0. 58 Katsumata B. lactofermentum 100 58 0. 58 Ishida S. marcescen 96 100 1. 04 Masuda E. coli 72 65 0. 90 Shimizu E. coli 77 100 1. 30 Okamoto Giống Tác giả

L-Threonin - ứng dụng acid amin thiết yếu cho con người và vật nuôi như heo, gia cầm. l Nó được dùng làm chất bổ sung cho thức ăn động vật, dược phẩm, thức ăn, mỹ phẩm. l Trên thế giới, mỗi năm sản xuất khoảng 13. 00014. 000 tấn l

L-Aspartic Acid l l l Sản xuất bằng công nghệ enzym 1 hoặc 2 giai đoạn Nguyên liệu đầu là fumarate (1 giai đoạn) hoặc maleate (2 giai đoạn) Enzym aspartase được cố định trên nhựa trao đổi ion E. coli sinh aspartase được cố định trong polyacrylamid hay K-carageenan E. coli sinh aspartase được cố định trong polyurethane và polyazetidine Công nghệ gen: chủng coryneform có hoạt tính maleate isomerase và aspartase, nồi phản ứng màng

L-Aspartic Acid Maleaic acid Fumaric acid

L-Aspartic Acid - ứng dụng dịch truyền dinh dưỡng, phụ gia thực phẩm, l nguyên liệu sản xuất aspartame, aspartylphenylalanine methyl ester. l sản xuất polymer có thể phân hủy sinh học. l dùng như xà phòng, tác nhân chelat hóa hay xử lý nước l

L-Alanine Công nghệ enzym với aspartate β-decarboxylase l Pseudomonas dacunhae cố định trên polyacrilamide, κcarageenan, nhồi cột l

PHẦN 5 Thực phẩm chức năng

Một số định nghĩa l l l l Thực phẩm chức năng (functional food) Thực phẩm tăng cường (fortified food) Dược thực phẩm (nutraceutical) Tinh chất thực vật (phytochemical) Dược mỹ phẩm (cosmeceutical) Chất trợ sinh (probiotic) Chất tiền sinh (prebiotic) Thực phẩm Chức năng Dược phẩm

Prebiotic - yêu cầu Không được thủy phân hay hấp thu ở đoạn trên của ống tiêu hóa l Là cơ chất chọn lọc của một hay một số giới hạn vi khuẩn có lợi sống hội sinh trong ruột già, do đó các vi khuẩn này sẽ được kích thích tăng trưởng hay chuyển hóa l Có khả năng thay đổi thành phần hệ vi khuẩn ruột già theo hướng có lợi l Tạo ra các hiệu ứng có lợi tại chổ hay toàn thân đối với người sử dụng. l l carbohydrate không tiêu hóa được: các oligo fructose, glucose, xylose và galactose

Prebiotic - chức năng l l l l kiểm soát thời gian lưu chuyển thức ăn qua ruột cải thiện hấp thu glucose, giảm hấp thu chất béo và cholesterol, tăng thể tích và khả năng giữ nước của thức ăn trong ruột non, điều hòa sự lên men vi sinh vật để làm tăng sản xuất các acid béo chuỗi ngắn, giảm p. H và ammoniac. giảm các rối loạn đường ruột (táo bón và tiêu chảy), bệnh tim mạch, và ung thu ruột

Probiotic - các yêu cầu chung l l l Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có thể đưa vào sản xuất. Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm. Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm. Có khả năng sống sót khi đi qua đường tiêu hóa (dạ dày-ruột non) nếu được sử dụng qua đường này. Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng. Có khả năng thực hiện chức năng trong môi trường nơi chúng được định hướng.

Probiotic - yêu cầu an toàn l l l l Có định danh chính xác Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người. Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh. Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh. Không liên quan tới bệnh tật, ví dụ như nhiễm trùng nội mạc cơ tim, hay gây rối loạn tiêu hóa. Không gây khử liên hợp muối mật. Đặc điểm di truyền ổn định. Không mang các gen đề kháng sinh có thể truyền được.

Probiotic - yêu cầu chức năng l l l l l Có khả năng dung nạp với acid và dịch vị của người. Có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non). Có khả năng bám dính vào bề mặt niêm mạc ruột và tồn tại lâu dài trong đường tiêu hóa. Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây viêm. Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên. Sản xuất các chất kháng sinh vi sinh vật (ví dụ bacteriocin, hydrogen peroxide, acid hữu cơ) Có hoạt tính đối kháng với tác nhân gây bệnh như Helicobacter pylori, Samonella sp. , Listeria monocytogenes và Clostridium difficile. Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư. Các lợi ích khác được chứng minh trên lâm sàng.

Probiotic - yêu cầu công nghệ l l l Có những đặc tính tốt về cảm quan. Đề kháng với thực khuẩn. Dễ sản xuất: tăng trưởng đủ mạnh, dễ thu hoạch. Có khả năng sống sót trong quá trình sản xuất. Ổn định trong quá trình sản xuất và bảo quản. Có thể đánh giá chất lượng khi được trộn vào sản phẩm cuối cùng.

Probiotic - ứng dụng l Cho người: l l Phòng bệnh, tình trạng sức khỏe Điều trị một số rối loạn hệ vi sinh vật Điều trị: bệnh Crohn, tiêu chảy trẻ em, viêm ruột, tiêu chảy do Clostridium Thú y và Thủy sản: l l l Biện pháp hạn chế sử dụng kháng sinh Giúp tăng trọng Phòng bệnh

Probiotic - một số lưu ý Tính chất của một sản phẩm probiotic là một thuộc tính của chủng được sử dụng không phải là của loài được sử dụng l Các tính chất phải được chứng minh bằng thử nghiệm in vitro, in vivo hay lâm sàng l

PHẦN 6 Công nghệ enzym

Khái niệm xúc tác sinh học l l l Enzym là chất xúc tác của các quá trình sinh học, Bản chất là protein Giúp phản ứng đạt được điểm cân bằng nhanh hơn Enzym không thể xúc tác phản ứng với sự thay đổi năng lượng tự do không thuận lợi trừ khi phản ứng đó có thể song hành với một phản ứng khác có sự thay đổi năng lượng tự do thuận lợi hơn Giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn trong điều kiện bình thường về áp suất, nhiệt độ, p. H

Công nghệ enzym hiện đại l l l Hóa học protein Lý sinh phân tử Sinh học phân tử Cấu trúc, hoạt động của protein-enzym Can thiệp để thay đổi phân tử protein-enzym

Nhu cầu sử dụng enzym Chỉ tiêu Công nghiệp Phân tích Dược phẩm Lượng sử dụng Tấn Milligam Độ tinh khiết Không tinh khiết Tinh thể tinh khiết Nguồn gốc Vi sinh vật, thường ngoại bào Vi sinh vật, động vật, thực vật, thường nội bào Giá sản xuất Thấp Trung bình Cao

Xúc tác sinh học l Tính chọn lọc cao l l l l Chọn lọc theo vị trí nhóm hóa học Chọn lọc không gian Hoạt động trên cơ chất đa dạng Hoạt động được trong môi trường không phải là nước Khả năng đảm nhận lượng cơ chất cao Có độ bền đủ cao Tính kinh tế

Tính chọn lọc theo vị trí

Tính chọn lọc không gian

Nguồn cung cấp enzym l Chiết tách l l l Động vật Thực vật Lên men l l l Vi sinh vật Nuôi cấy tế bào Công nghệ gen

Sản xuất enzym Chuẩn bị nguyên liệu sinh học l Chiết tách enzym ra khỏi mô hay tế bào l Cô đặc dịch enzym thô l Tinh chế đạt độ tinh khiết mong muốn l

Chuẩn bị nguyên liệu sinh học l Cơ quan động vật l l l Nguyên liệu thực vật l l l Loại chất béo và mô liên kết trước khi đông lạnh Bảo quản lạnh đến khi đủ mẫu để xử lý Nghiền trên máy nghiền thịt và enzym được chiết với dung dịch đệm. Enzym để phá vỡ tế bào Thực vật có thể được nghiền và chiết với dung dịch đệm. Tế bào cũng có thể được phá vỡ bằng cách xử lý với enzym. Vi sinh vật l l Ngoại bào: tách tế bào ra khỏi dung dịch lên men. Nội bào: phá vỡ tế bào

Các phương pháp phá vỡ tế bào Phương pháp cơ học Phương pháp khác Áp suất cao (Manton - Gaulin, French-press) Làm khô (đông khô, dung môi hữu cơ) Nghiền (máy nghiền bi) Ly giải: Nghiền (máy nghiền bi) Vật lý: đông lạnh, sốc thẩm thấu Hóa học: chất tẩy, kháng sinh Enzym: lysozyme, kháng sinh

French-press

Chiết tách Ly tâm l Lọc l l l Cross-flow Tủa bông

Cô đặc Bay hơi l Kết tủa l l l Muối Dung môi hữu cơ Polymer Siêu lọc

Tinh chế Kết tinh l Điện di l Sắc ký l Loại sắc ký Nguyên lý Tách theo Hấp phụ Liên kết bề mặt Ái lực bề mặt Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cực Trao đổi ion Liên kết ion Điện tích Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thước và hình dạng phân tử Ái lực Hấp phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tử Kỵ nước Tương tác kỵ nước Cấu trúc phân tử Đồng hóa trị Liên kết đồng hóa trị Tính phân cực Đánh bắt ion kim loại Sự thành lập phức Cấu trúc phân tử

Enzym cố định l Ưu điểm l l l Enzym có thể được sử dụng lặp lại nhiều lần Chế phẩm bền hơn enzym tự do Enzym cố định có tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản xuất ở mức độ tự động hóa cao. Nhờ sự cố định mà enzym không lẫn vào sản phẩm cuối Enzym cố định bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng loại Nhược điểm l l Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu. Cản trở về không gian do liên kết với chất mang làm hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất.

Vật liệu cố định l l l Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm hoặc dễ tổng hợp Chất mang phải có tính cơ lý ổn định Chất mang phải bền vững về mặt hóa học, không hòa tan trong môi trường phản ứng. Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn Có khả năng trương nở trong môi trường

Các phương pháp cố định enzym Phương pháp liên kết với chất mang Đặc tính Hấp phụ vật lý Liên kết ion Liên kết đồng hóa trị Phương pháp khác Liên kết chéo Bắt giữ Kỹ thuật Dễ Dễ Khó Hoạt tính enzym Thấp Cao Trung bình Cao Tính đặc hiệu cơ chất Không đổi Thay đổi Không đổi Lực liên kết Yếu Trung bình Mạnh Khả năng tái cố định Có thể Không Khả năng ứng dụng Thấp Trung bình Thấp Cao Chi phí cố định Thấp Trung bình Thấp Không Cao Khó

Cố định thuận nghịch

Cố định không thuận nghịch

Ứng dụng enzym trong ngành dược Liệu pháp enzym l Enzym trong sản xuất thuốc l

Liệu pháp enzym Thay thế các enzym bị mất hay kém chức năng do bệnh di truyền; l Thay thế enzym bị mất hay kém chức năng do một bệnh mắc phải ở các cơ quan chịu trách nhiệm tổng hợp chúng; l Cung cấp một tác dụng sinh học đặc hiệu do đặc tính xúc tác của enzym l

Liệu pháp enzym l l l l Phải đến được vị trí tác động của chúng trong cơ thể hay mô. Phải có hoạt tính trong các điều kiện môi trường tại nơi tác động. Chúng phải đủ bền để có được các thông số dược động học cần thiết, Độ tan thỏa mãn yêu cầu nếu được dùng theo đường tiêm bắp hay dưới da. Độ tinh khiết đủ cao Có hiệu quả điều trị dựa trên hoạt tính đặc hiệu của enzym được dùng. Hiệu quả của liệu pháp phải được chứng minh An toàn đối với bệnh và chỉ định điều trị Dạng sử dụng thuận tiện

Các vấn đề của thuốc protein l Không ổn định Sinh khả dụng Tính thấm tế bào Tính chất gây miễn dịch Phản ứng dị ứng Sản xuất và kiểm định l Lợi thế l l l l Ít tác dụng phụ hơn Thời gian phát triển ngắn

PHẦN 7 Sản xuất thuốc bằng công nghệ enzym

Thuốc đối quang l l l Cấu trúc không gian của phân tử sinh học và thụ thể Chỉ một trong hai đồng phân có hoạt tính, Các đồng phân có hoạt tính khác nhau Dược động học và chuyển hóa khác nhau Thuốc tinh khiết quang học (enantiopure Bản quyền đồng phân

Thuốc đối quang Tác dụng dược lý chính Khác biệt giữa các đồng phân Thuốc chẹn β: l > d (d = không có hoạt tính) propranolol, acebutolol, atenolol, alprenolol, Ví dụ: S( ) propranolol > R(+) propranolol betaxolol, carvedilol, meto prolol, labetalol, pindolol, sotalol, … Thuốc chẹn kênh calci: verapamil, nicardipine, nimodipine, nisoldipine, felodipine, mandipine … l>d Ví dụ: S( ) verapamil > R(+) verapamil Thuốc giãn phế quản: albuterol (salbutamol), salmeterol và terbutaline l > d (d = không có hoạt tính) Ví dụ: R( ) albuterol > S(+) albuterol An thần: hexobarbital, secobarbital, mephobarbital, pentobarbital, thiopental, thiohexital l>d Ví dụ: S( ) secobarbital > R (+)secobarbital Thuốc gây mê: ketamine, isoflurane d > l (l = không có hoạt tính) Ví dụ: S(+) ketamine > R( ) ketamine S(+) isoflurane > R( ) isoflurane Giảm đau tác động trung ương: Methadone Ví dụ: R( ) methadone > S(+) methadone Kháng viêm không steroid: ibuprofen, ketoprofen, benoxaprophen, fenprofen d>l Ví dụ: S(+) ibuprofen > R( ) ibuprofen An thần: nhóm 3 hydroxy benzodiazepines: oxazepam, lorazepam, temazepam d > l (l = không có hoạt tính) Ví dụ: S(+) oxazepam > R( ) oxazepam

Thuốc đối quang - racemic

Các loại phản ứng được xúc tác bởi enzym Lớp enzym theo IUBMB Phản ứng xúc tác EC 1 Oxidoreductases Oxi hóa/khử đối với –CH–OH, –C=O, –C=C, … Không đòi hỏi đồng cơ chất EC 2 Transferases Không đòi hỏi đồng yếu tố Chuyển các nhóm chức như halogen, aldehyde, keto, acyl, glycosyl, … EC 3 Hydrolases Không đòi hỏi đồng yếu tố Thủy phân/ngưng tụ các ester, glycosid, nitril, amid, halogen, … EC 4 Lyases Không đòi hỏi đồng yếu tố Thêm/loại bỏ; cắt các liên kết C–C, C–O, C–N EC 5 Isomerases Không đòi hỏi đồng yếu tố Đồng phân hóa, chuyển dạng cis trans, epime hóa EC 6 Ligases Cần đồng cơ chất ATP Tạo các liên kết C–O, C–S, C–N, C–C

Một số vấn đề công nghệ l l l l Chi phí cố định phải bù đắp được bởi sự gia tăng tính ổn định hoặc hoạt tính. Giảm thiểu sự mất hoạt tính trong quá trình cố định. Khi enzym được cố định bằng phương pháp có tính thuận nghịch, sự rò rỉ enzym phải được nghiên cứu và có biện pháp thích hợp. Sự giới hạn về luân chuyển vật chất trong chất mang cần được tính toán khi điều chỉnh p. H hay nhiệt độ trong quá trình phản ứng. Với enzym tự do, hoạt tính chuyển hóa có thể đạt được cao hơn ở nồng độ enzym cao, do đó việc chuyển hóa các cơ chất khó có thể thực hiện được. Tính vô trùng của phản ứng cần được quan tâm. Sự tương thích của dung môi với chất mang và ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính cần được xem xét.

Lựa chọn nồi phản ứng A: vận hành theo lô; B: vận hành theo lô có tuần hoàn; C: thùng khuấy có siêu lọc; D: thùng khuấy vận hành liên tục; E: thùng nhồi liên tục; F: tầng sôi liên tục

Động học phản ứng

Oxidoreductase § Nucleoside oxidase lấy từ Stenotrophomonas maltophilia (FERM BP-2252) § Sản xuất các dẫn xuất 5’-carboxylic acid của các nucleoside đồng đẳng. § Enzym thô từ dịch chiết tế bào § Hoặc enzym cố định trên Eupergit-C

Lipase Thuốc hạ cholesterol

Lipase Thuốc ngừa thai tác dụng kéo dài (1 viên/tuần)

Lipase Thuốc chống trầm cảm

Lipase Thuốc kháng viêm không steroid

Amidase Thuốc kháng HIV

Deaminase Thuốc kháng virus (HBV, HIV)

Lyase Vitamin B 3

KẾT THÚC