Clostridium botulinum Prof Dr Gknur TERZ GLEL n

Clostridium botulinum Prof. Dr. Göknur TERZİ GÜLEL

n n Botulismus; anaerob, spor oluşturma özelliğindeki Clostridium botulinum'un vejetatif formları tarafından oluşturulan sinir sistemine etkili nöro paralitik toksinlerin (botulin, botulinum neurotoxin) alınması sonucu oluşan, yüksek mortaliteye sahip bir intoksikasyondur. Toksinler gıdada oluşturulur, ince bağırsaklarda emilir, kan dolaşımı yoluyla taşınır ve sonunda sinir sistemi tarafından absarbe edilirler.

n n n Toksinler başta periferal sinirler olmak üzere spesifik olarak sinir sistemi üzerine etkili olduğundan nörotoksin olarak adlandırılırlar. Oral yolla alınan toksin A'nın insanlar için letal dozunun 0. 1 1. ug olduğu ve 1 g toksinin milyonlarca insanı öldürebilecek güce sahip olduğu tahmin edilmektedir. Saflaştırılmış botulinum toksinleri (Botox) medikal amaçlı olarak spastik çocuklarda, yüz felci sonucu oluşan bazı nörolojik hastalıkların tedavisinde, terlemeyi önlemek için ve estetik amaçlı kullanılmaktadır.

Botulismusun 3 formu bulunmaktadır. Bunlar: n Klasik form n Yara botulismusu n İnfant botulismusu

n Klasik form: gıdalarda oluşan toksinlerin neden olduğu formdur. n Yara botulismusu: infekte yaralardan kaynaklanan etkenin A ve B tipleri tarafından oluşturulan ve çok nadir görülen bir formdur. İnkübasyon periyodu 4 14 gündür. Semptomları gıda zehirlenmesinde olduğu gibidir.

n n İnfant botulismusu, bir yaşın altındaki çocuklarda (% 90‘ı 2 hafta 6 ay arası), genellikle bal, şurup veya çevresel yolla alınan C. botulinum tip A ve B sporlarının bağırsaklarda gelişmesi, çoğalması ve toksin oluşturması sonucu meydana gelir ve konstipasyon, halsizlik, başı kontrol edememe, refleks kaybı gibi spesifik semptomlar ile karakterizedir. İnfant botulismusunun oluşumunda çocukların bağırsak floralarının C. botulinum kolonizasyonuna duyarlı olması nedeniyle demir ile zenginleştirilmiş bebek mamalarının (C. botulinum gelişmesi için demire ihtiyaç duyar) rol oynadığı bildirilmektedir.

Klasifikasyonu ve Genel Özellikleri Clostridium botulinum, Clostridiaceae familyasında n n n n yer alan Gram pozitif, çubukçuk formunda zorunlu (obligat) anaerob, spor formlu, çogu peritrik flagellaları ile hareketli, çubuk şeklinde (3 8 um/0. 9 1. 2 um) bir bakteridir. Sporları ovalden silindire, terminalden subterminale değişmektedir. Olgun sporlar tenis raketi formundadır. Clostridium botulinum DNA homolojileri, serolojik ve kültürel özellikleri esas alınarak 4 alt gruba ayrılmıştır: Grup 1: Tip A'nın tamamı ile B ve F'nin proteolitik suşları (proteolitik) Grup 2 : Tip B ve F'nin proteolitik olmayan suşları ile tip E'nin bütün suşları (non-proteo/itik) Grup 3 : Tip C ve D suşları (non-proteolitik) Grup 4 : Zayıf proteolitik, sakkarolitik olmayan G suşları (zayıf proteolitik)

n n Clostridium botulinum'un optimal üreme sıcaklığı proteolitik tipler için 35 40 o. C, proteolitik olmayan tipler için 25 40°C'dir. Proteolitik tipler genelde 10 12. 5°C'nin altında üremezler. Buna karşın proteolitik olmayan suşlar 3. 3°C'de dahi üreyebilirler. Proteolitik suşlar ısı işlemine proteolitik olmayanlardan daha çok dirençlidirler. Bu çerçevede A tipi en dirençli tip olup bunu proteolitik F ve B tipleri izler. A ve B tipi sporlar kaynatmaya 6 dakika dayanmaktadır. C ve D tiplerinin sporları ısıya daha duyarlıdır

n n n Clostridium botulinum'un minimal p. H değeri, sıcaklık ve aw değerine bağlı olarak değişkenlik göstermektedir. Genel olarak bu değer 4. 6 olup, konserve endüstrisinde büyük önem taşır. Ayrıca proteolitik olmayan suşların aside dirençleri daha zayıf olup, gelişmeleri p. H değeri 5. 0 5. 2'de baskılanır. Etkenlerin gelişmesi için maksimal p. H değeri ise, 8. 5 8. 9 arasındadır. Toksin alkali p. H değerlerinde stabil değildir.

n n A ve proteolitik B tipleri için minimum aw değeri 0. 94, E tipi için 0. 97'dir. Tuza dirençlilik tipe göre değişkenlik göstermekte; A ve B tipi % 10'a kadar tuzu tolere ederken, E tipi suşların üremesi % 4. 5 5'te baskılanmaktadır. Özellikle kürlenmiş et ve et ürünlerine ilave edilen nitrit C. botulinum'un gelişmesinin kontrol altına alınmasındaki en önemli katkı maddesidir. C. botulinum'un bütün tiplerinde Eh değeri 6 ila 500 m. V arasında değişmektedir

n n n Aminositleri deamine ve dekarboksile ederler, sistini desülfürize ederek H 2 S oluştururlar. Yine bütün tipler aminoasitlerden NH 3, H 2 S, CO 2 ve uçucu aminler oluştururlar. Proteolitik tipler, proteolitik olmayan tiplerden farklı olarak kazeini parçalayarak H 2 S oluştururlar. Buna karşın, proteolitik olmayanlar mannozu fermente ederler. Toksin oluşumu için birçok aminoasit, glikoz, B vitamini ve mineral maddelere gereksinim vardır. Büyük elektronegatif potansiyele sahip Fe+++ ve AI+++ bakterinin hızla gelişmesini sağlar. Zn, Ni, Hg, Sn, Co ve Mg gibi metaller sporların germinasyonunu inhibe ederler.

n n Mikroorganizmaların C. botulinum üzerine etkileri baskılayıcı veya gelişimini kolaylaştırıcı niteliktedir. Özellikle Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus gibi laktik asit bakterilerinin (p. H'yl düşürmeleri, bakteriyosin oluşturmaları) ortamda çok sayıda bulunmaları halinde zayıf rekabet gücünden dolayı C. botulinum'un üremesi ve toksin oluşturması baskılanır. Dolayısıyla, fermente et ve et ürünlerinin üretiminde laktik starter kültürlerin kullanılması patojen bakterinin kontrolünde büyük yarar sağlar. Buna karşın ortamda aside dirençli maya ve mantarların varlığı ve metabolik aktivasyonu (redoks potansiyelinin düşmesi p. H'nın 4. 6 ve üzerine yükselmesi) C. botulinum'un gelişmesi için uygun ortam sağlar. Vakum paketleme de etkenin gelişmesine ve toksin oluşturmasına yardım eder.

Botulinal Toksinler (Nörotoksin, Bo. NT): n n C. botulinum toksinleri, molekül ağırlıkları genel olarak 150 k. Da olan ve 200 900 k. Da arasında değişen yüksek molekül ağırlıklı proteinlerden oluşur. Bütün toksin tipleri benzer özelliktedir. Bo. NT bilinen en etkili zehir olup, 0. 1 1 mikrogramı bir insanı öldürebilmektedir. Letal dozlarının çok düşük olması toksinin en belirgin özelliğidir. Yaklaşık 1 mg toksinin 20 milyon fareyi öldürebilecek etkiye sahip olduğu bilinmektedir. Toksin molekülleri hücre içinde oluşturulur, hücrenin lize olması ya da hücre sekresyonu ile hücre dışına geçer. Toksinler protein yapısında olduklarından ısı ile kolayca yıkımlanırlar. Bu çerçevede A ve B tipleri 80°C'de 10 dakikada, E tipi 70°C'de 5 dakikada yıkımlanır.

n n Toksinler, bulundukları kompleks yapı içerisinde asidik koşullara (p. H 3. 5 6. 5) hafif alkali koşullardan daha dayanıklıdır. Toksinler gamma ışınlarına spor formlarından daha dirençlidirler. Clostridium botulinum nadiren memelilerin ve kanatlı hayvanların sindirim kanalında bulunmakla birlikte esas olarak bir toprak saprofitidir. C. botulinum' un serolojik olarak birbirinden ayrılabilen ve A, B, C, D, E, F ve G olarak tanımlanan 7 tip toksini bulunmaktadır. C tipi C alfa ve C beta olmak üzere iki tiptir ve bunlar da, C 1 ve C 2 olmak üzere iki tür toksin oluştururlar. Ancak C 2 toksini sitotoksik özelliği nedeniyle diğer klasik toksin tiplerinden ayrılır. Bazı Clostridium suşları C ve D tipi toksinieri birlikte üretmektedir.

n n İnsanlarda botulinum intoksikasyonlarının çoğu A, B ve E, nadiren F tipi toksinler tarafından meydana getirilir. Diğer toksinlere evcil ve yabani hayvanlarda rastlanır. Hayvanlar için patojen predominant toksin tipleri C (tavuk, sığır, mink vd. ) ve D tipleri (özellikle sığırlarda) olmakla birlikte A, B ve E tipleri de nadiren intoksikasyonlara neden olmaktadır. C ve D tipi toksin ile zehirlenme insanlarda çok ender olarak görülür. C. botulinum'un G tipine ilişkin teyit edilmiş bir gıda intoksikasyonu bulunmamaktadır. Bu tip C. argentinense olarak adlandırılmıştır.

Toksin Oluşumu için Gerekli Koşullar: soru Clostridium botulinum'un gelişmesi ve toksin oluşturmasında başta ortamın anaerob olmasının yanı sıra; etkenin tipi, substratın yapısı, besin maddelerinin kompozisyonu, asiditesi, tuz konsantrasyonu, su aktivitesi, sıcaklık, oksijen konsantrasyonu, diğer mikroorganizmaların ve inhibitörlerin varlığı gibi birçok faktör rol oynar. Bu faktörler şunlardır: n Anaerobiozis n Sıcaklık: Tip A ve B'de 10 12. 5°C , Non proteolitik Tip B, E ve F (psikrotrof) için 3. 3°C (31 45 günde) n aw değeri: < 0. 94 ve 0. 96'da toksin oluşmaz n p. H değeri: 4. 6 5. 0 (sınır değer) n

Semptomlar n n n İnsanlarda botulismusa genellikle Grup 1 ve 2'de yer alan A, B veya E tipleri neden olur. A ve B tiplerine normal sıcaklıktaki bölgelerde, E tipine kuzey yarıkürenin soğuk bölgelerinde rastlanmaktadır. Nöroparalitik bir hastalık olan botulizmin meydana gelmesi için; gerekli şartlar nelerdir? i) gıdanın toksijenik C. botulinum'un spor veya vejetatif formları ile kontamine olması, ii) vejetatif veya spor formların gıdanın işlenmesi sırasında canlılığını koruması veya gıdaların işlem sonrası kontaminasyonu, iii) bakterinin gıdada uygun koşullarda çoğalması ve toksin oluşturması, iv) toksin içeren gıdanın yeterli ısı işlemi görmeksizin tüketilmesi gerekmektedir.

n Toksinler lenf ve kan ile taşınır, sinirler üzerine, özellikle periferal sinirler üzerine etkir ve nöromuskuler paralize neden olur. Etki mekanizması, kolinerjik sinir uçlarının presinaptik bağları üzerine ve asetil kolin salınmasının inhibisyonu şeklindedir. Bu engelleme 3 aşamada şekillenir; n i) toksin molekülleri sinir uçlarındaki reseptörlere bağlanır, n ii) toksin molekülü veya onun bir parçası sinirlere dahil olur, n iii) sinir hücresi içinde asetil kolin salınmasını engeller. Bu durum, impulsların sinapslar boyunca transferini engelleyerek etkilenen kasların paralizine neden olur

n n n Gıda kaynaklı botulismus intoksikasyonları nöroparalitik bir sendromla karakterize olup, gastrointestinal bozukluklarla birlikte seyreder ve özellikle ilk 24 saatte yüksek mortalite ile sonlanır. ilk semptomlar spesifik olmayabilir; örneğin mide bulantısı, kusma, diyare gibi enteral semptomlar toksinin alınmasından 12 36 saat (5 saat ile 1 2 hafta) sonra görülebilir. İlerleyen dönemlerde görülen kabızlık ve abdominal ağrı botulismus olgularındaki tipik semptomlardandır. Daha sonra halsizlik, ağız ve boğaz kuruluğu ile yutkunma güçlüğü görülür. Bundan sonra paraliz belirtileri ortaya çıkar. Akomodasyon bozukluğu, ışıkta yavaş pupillar reaksiyon, çift veya bulanık görme, motor sinirlerin paralizi, yüz kaslarının tutulması, konuşma ve yutkunma güçlüğü, dil, sırt ve ekstremite kaslarında fonksiyon güçlüğü bu belirtiler arasında yer alır.

n n n Ateş yoktur veya bazen düşük ateş görülür. Felç ilerleyerek devam eder ve frenicus felcine bağlı olarak solunum güçlüğü artar. Ölüm, vakaların çoğunda semptomlar ortaya çıktıktan sonraki 24 saatten daha kısa sürede veya 3 5 gün içinde solunum felci veya kalbin durması sonucu şekillenir. Eğer hasta ilk 10 günü geçirirse prognoz iyi kabul edilir. Olgunun şiddetli seyrettiği durumlarda, özellikle E tipi toksine bağlı zehirlenmelerde toksin alınmasından 20 24 saat sonra ölüm meydana gelmektedir. Ölüm oranı, alınan toksin tipi ve coqrafi lokalizasyona göre % 8 80 arasında değişmektedir. Almanya, Fransa gibi bazı Avrupa ülkelerinde C. botulinum intoksikasyonlarında mortalitenin düşük olması, bu ülkelerde B tipine sıklıkla rastlanması ve bu tipin letal etkisinin A tipinden daha düşük olmasından ve olgulara erken müdahaleden kaynaklanmaktadır.

TEDAVİ n n n Toksinler antijenik yapıda olduğundan tedavi, hastalığın erken döneminde toksin tipine spesifik antitoksinler ve destek tedavisi ile mümkündür. Hastalığın iyileşme süreci oldukça uzun olup 8 aya kadar sürebilir. Clostridium botulinum intoksikasyonlarında tedavi spesifik antiserumlarla yapılmakta ve özellikle başlangıç fazında başarı yüksek olmaktadır. Bu nedenle intoksikasyondan şüphelilerin en seri şekilde sağlık merkezlerine ulaştırılması tedavide büyük önem taşımaktadır

Gıdalarda ve Çevrede Varlığı ve Gıda Kaynaklı C. botulinum İntoksikasyonları n n n Clostridium botulinum, başta toprak olmak üzere, tatlı ve tuzlu su. Iarda ve çoğu hayvanların bağırsaklarında bulunan ubiquiter özellikte bir bakteridir. Toprağın kontaminasyonunda hayvan gübrelerinin ve lağım sularının kullanılmasının etkili olduğu sanılmaktadır. Oldukça geniş bir dağılıma sahip olmakla birlikte C. botulinum tipleri dünya coğrafyasında homojen bir dağılım sergilemez. Gıda kaynaklı botulismus olgularında A tipine, ABD'nin batısı, Rusya, Çin, Brezilya ve Arjantin'de; B tipine, Avrupa'da ve ABD'nin doğusunda; E tipine, K. Amerika, Kanada, İskandinavya, Baltık ülkeleri ve Japonya'da; F tipine ise Danimarka'da rastlanır. C. botulinum'un E tipi intoksikasyonuna özellikle kuzey yarıkürenin soğuk bölgelerinde, Japonya'nın kuzeyinde, Alaska, Kanada, İskandinavya ve Rusya Ferderasyonu ile İran'da daha sıklıkla rastlanır. E tipi intoksikasyonlardan sorumlu tutulan gıdaların tamamına yakınını deniz ürünleri oluşturmaktadır. Buna karşın C ve D tipleri çoğunlukla sıcak çevrelerde bulunmaktadır.

n n Clostridium botulinum intoksikasyonlarının oluşumunda etkenin çevrede (toprak, su) yaygın olarak bulunması sonucu ürünlerin elde edilmesi aşamasında kontamine olmaları veya işlem görmeleri sırasındaki kontaminasyonu önem taşımaktadır. Değişik ülkelerde yapılan çalışmalar sebze ve meyveler, balık ve işlem görmüş balık ürünleri, kırmızı et ve kanatlı eti ile ürünleri, bal ve bebek mamalarının C. botulinum sporları ile kontamine olduğunu ortaya koymaktadır. Clostridium botulinum intoksikasyonlarının oluşumunda ev yapımı sebze konserveleri (% 90) ile tüketime hazır modifiye atmosferle paketlenmiş gıdalar ilk sıralarda yer almaktadır. Ticari konservelerden kaynaklanan intoksikasyonlar ise özellikle termal inaktivasyona ilişkin hatalar sonucu ortaya çıkmaktadır.

n n Konserve veya vakum paketli işlenmiş (dumanlanmış, kürlenmiş, fermente vb. ) et ve et ürünleri. Konserve, işlem görmüş balık ve diğer su ürünleri. Sebze konserveleri; özellikle ev yapımı düşük asitli sebze konserveleri, yeşil fasulye, bezelye veya diğer kabuklu sebzeler, ıspanak, hardal, mantar, pişmiş patates, patates salatası, yağ içerisinde sa rımsak. Bal (aw değeri düşük olmasına karşın, etken özellikle ölü larvalar içerisinde korunur ve infant botulismusunu oluşturur) ve bazı bebek mamaları.

Korunma ve Kontrol n n n Gıdaların üretim, işleme veya muhafaza edilmeleri aşamalarında C. botulinum ile kontaminasyonu önlenmeye çalışılmalıdır. Mevcut vejetatif ve spor formlar uygun yöntemlerle inaktive edilmelidir. Özellikle ticari konserve yapımında etkin ısı işlemi uygun F değeri seçilerek uygulanmalı ve kontrolü yapılmalıdır. Konservele rin soğutulmasında klorlanmış temiz su kullanılmalıdır. Sporların germinasyonu ve vejetatif hücrelerin çoğalarak toksin oluşturması önlenmelidir. Oluşan toksinler imha edilmelidir. Evlerde konserve yapımına ilişkin risk konusunda toplum aydınlatılmalı, bombaj oluşturan konserveler tüketilmemeli, bir yaşın al tındaki çocuklar bal ile beslenmemelidirler.

Üreme ve toksin oluşumunu engelleyecek koşullar: n n soğuk muhafaza (Grup I < 10 °C; Grup II <3, 3°C) aw < 0. 94 p. H < 4. 6 redoks potansiyeli (max. Eh değeri +30 ile +250 m. V)

Sporların Isı ile Yıkımlanması (Termal inaktivasyon): n n C. botulinum sporları başta ısı işlemi olmak üzere kurutma ve kimyasal inhibitörlere karşı çok dirençlidir. Bu nedenle sporların yıkımlanması için uygun ısı zaman parametrelerine ihtiyaç vardır. Sporların ısıya direnci üzerine p. H değeri, Na. Cl, nitrit gibi birçok faktörün etkisi vardır. Herhangi bir gıdada mevcut C. botulinum sporlarının tamamının yıkımlanması halinde vejetatif kültürlere germinasyonu olamayacağından botulismus meydana gelmez. Bu bakımdan uygulanan ısı işlemlerinde C. botulinum sporlarının tamamının yıkımlanması amaçIanır.

n n Isı işlemi uygulaması ile bakterilerin öldürülmesinde D değeri kullanılır. Bu değer, mevcut mikroorganizmaların % 90' ının veya 1 logaritmik değerinin belirli bir sıcaklıkta yıkımlanması için gerekli dakika biriminden zamandır (D value; decimal reduction time; desimal indirgenme zamanı). C. botulinum Grup 1 için D 100 değeri yaklaşık 30 dakikadır. 121°C gıda endüstrisi için referans değer olup, dirençli A ve B tipi sporları için D 121. 1 değeri, 0. 10 0. 20 dakikadır. Diğer taraftan proteolitik suşlar proteolitik olmayanlardan daha dayanıklıdır. A ve B tipi sporlar kaynatmaya 6 dakika dayanırken, E tipi sporlar 80°C'de 15 dakikada inaktive olur. C. botu/inum sporlarının ısıya direnci düşük p. H'da azalırken, düşük aw değeri ile protein ve lipid varlığında artmaktadır.

n n n Botulinal toksinlerin ısıya duyarlı olmaları ve yüksek, üniform ısı uygulaması ile (90°C 15 dakika veya 5 dakika kaynatma) inaktive edilmelerine karşın, çok düşük miktarlardaki toksinin dahi yüksek öldürücü etkiye sahip olması dikkate alınarak şüpheli gıdalar tüketilmemelidir. Clostridium botulinum'un sporları irradyasyona çok dayanıklıdır. Ayrıca ışınlama gıdaların çoğu için pratik anlamda uygulanamamaktadır. Işınlamaya dirençli sporların yıkımlanabilmesi için gerekli olan yüksek dozdaki gamma ışınları aynı zamanda gıdada organoleptik bozuklukların oluşumuna da neden olmaktadır. Sporlar klora çok duyarlıdır. 4. 5 ppm serbest klorun p. H değeri 6. 5 olan fosfat buffer solüsyonunda 3 12 dakika uygulanması ile % 99. 9 düzeyinde spor redüksiyonu sağlandığı bildirilmektedir.

İnhibitörlerin kullanılması: n n n Rekabetçi flora: Özellikle bakteriyosin oluşturan laktik asit bakterileri inhibitör etkilidir. Ancak, Penicil/ium, C 1 adosporium ve Aspergil/us gibi asi de dirençli küfler, asidik gıdalarda p. H'yl yükseıterek C. botulinum'un gelişmesi ve toksin oluşturmasında yardımcı rol oynar lar. Nitrit: Özellikle kürlenmiş et ürünlerinde antibotulinal etkilidir. Nisin ve diğer bakteriyosinler: Özellikle peynirde etkili, ancak et ürün lerinde aynı etkiye sahip değildir. Polifosfatlar: Difosfatlar, nitrit ile kombine edildiğinde etkilidir. Sorbik asit: Potasyum sorbatın yüksek dozları inhibitörik etkilidir. Askorbatlar ve izoaskorbatlar: Nitrit ile birlikte kürlenmiş et ürünlerinde etkilidir.