Citokininek Pcsvradi Attila egyetemi docens Citokininek A citokininek

Citokininek Pécsváradi Attila egyetemi docens

Citokininek

A citokininek felfedezése és fogalma - Haberlandt, 1913: - van Overbeek, 1941: - Miller, Skoog, 1954: floemnedv, sejtosztódás kókusztej kinetin (6 -furfurilamino-purin, DNS degradációs termék) - Miller, Letham, 1961, 1963: transz-zeatin, a természetes citokinin Citokinin: purinvázas, sejtosztódást indukál, kallusztenyészet növekedését fenntartja (auxinnal együtt)

A citokininek felfedezése Plate 4 from Skoog and Miller (1957) showing the effect of the auxin to cytokinin ratio on the pattern of development Copyright © 2005 American Society of Plant Biologists Amasino, R. Plant Physiol. 2005; 138: 1177 -1184

A citokininek felfedezése Copyright © 2005 American Society of Plant Biologists Amasino, R. Plant Physiol. 2005; 138: 1177 -1184

A citokininek felfedezése Copyright © 2005 American Society of Plant Biologists Amasino, R. Plant Physiol. 2005; 138: 1177 -1184

Természetes citokininek

Szintetikus citokininek

Természetes citokininek transz-ZEATIN

Izoprenoid citokininek X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 Név Rövidítés H H N 6 -(D 2 -izopentenil)adenin i. PA H H H R N 6 -(D 2 -izopentenil)adenozin i. PAR CH 3 S H H R 2 -metiltio-N 6 -(D 2 izopentenil)adenozin MTi. PARMP H H H RP N 6 -(D 2 -izopentenil)adenozin 5’-monofoszfát H G H H N 6 -(D 2 -izopentenil)adenin-3 glükozid i. PA 3 G H H G H N 6 -(D 2 -izopentenil)adenin-7 glükozid i. PA 7 G H H H G N 6 -(D 2 -izopentenil)adenin-9 glükozid i. PA 9 G

Izoprenoid citokininek X 1 H H transz-zeatin Z H H H R transz-zeatin ribozid ZR H H H RP transz-zeatin-ribozid 5’monofoszfát ZRMP H G H H transz-zeatin-3 -glükozid Z 3 G H H G H transz-zeatin-7 -glükozid Z 7 G H H H G transz-zeatin-9 -glükozid Z 9 G H H H Ala lupinsav Z 9 Ala H H cisz-zeatin cis-Z H H H G cisz-zeatin-9 -glükozid cis-Z 9 G transz cisz

Aromás citokininek X 1 H H N 6 -benziladenin BA H G H H N 6 -benziladenin-3 -glükozid BA 3 G H H G H N 6 -benziladenin-7 -glükozid BA 7 G H H H G N 6 -benziladenin-9 -glükozid BA 9 G H H H Ala N 6 -benziladenin-9 -alanin BA 9 Ala H H H R N 6 -benziladenozin BAR

Szerkezet és funkció Hormonaktivitás csökken: - 3 -as, 7 -es N cseréje C-re - 8 -as pozícióba N (azapurin) - 2 -es, 3 -as pozícióban hidroxiláció Hormonaktivitás fokozódik: - N 6 -nál az alkillánc hosszúsága 5 C atomig - a szénlánc telítetlensége - 2 -es pozícióban halogén, 9 -be, -CH 3 - 2 -es pozícióban -S-CH 3 csoport

A szerkezet és hatás összefüggése Módosított purinvázas citokininek

Szerkezet és funkció Hormonaktivitás csökken: - 3 -as, 7 -es N cseréje C-re - 8 -as pozícióba N (azapurin) - 2 -es, 3 -as pozícióban hidroxiláció Hormonaktivitás fokozódik: - N 6 -nál az alkillánc hosszúsága 5 C atomig - a szénlánc telítetlensége - 2 -es pozícióban halogén, 9 -be -CH 3 - 2 -es pozícióban -S-CH 3 csoport

A szerkezet és hatás összefüggése Anti-citokininek (pszeudopurin váz)

A citokinin receptor

Bioszintézis 2 i. PP=Δ 2 -izopentenil pirofoszfát 2 i. PARMP= i-pentenil-adenozin-monofoszfát 2 i i. PAR= izopentenil adenozin i Z = zeatin DHZ = dihidrozeatin P P

Bioszintézis –további lehetőségek

Transzfer RNS-ben CITOKININ

Bioszintézis helye, habituáció, transzport • • Szintézis fő helye: gyökércsúcs Szállítás a xilémben Recirkuláció (floem) Reciklizálódás: tavasz / ősz • Habituáció: kallusz kultúrák autonómmá válása

A citokinin konjugátumok típusai TÍPUS • Citokinin ribozid és -ribozid-5’-foszfát • Citokinin-N-glükozid KAPCSOLÓDÁSI HELY N-9 N-3, N-7, N-9 • Citokinin O-glükozid O-4’ • Ribozil-citokinin-glükozid N-9, O-4’ • Citokinin-aminosav konjugátum N-9

Zeatin konjugátumok

A citokininek lebontása

A zeatin lebontási folyamata

A citokininek kimutatása • Immunológiai módszerek ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) RIA (Radio Immuno Assay) • HPLC (High Performance Liquid Chromatography) • GC-MS (Gas Chromatography - Mass Spectrometry) • ESI (Electrospray Ionization) • MECC (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography) • Biológiai tesztek + extrakciós technikák pl. SPE (Solid Phase Extraction)

A citokininek kimutatása

Kallusz növekedése A citokininek kimutatása zeatin kinetin -10 -9 -8 -7 Citokinin koncentráció, log [M]

A citokininek kimutatása Xanthium sziklevél teszt Növekedés, % benziladenin zeatin kinetin adenin Citokinin koncentráció [M]

A citokininek kimutatása Klorofill retenciós teszt Klorofill tartalom Kezdeti érték Kinetin koncentráció

A sejtosztódás szabályozása M G 2 G 1 Hagyma gyökércsúcs sejt interfázisban -DNS replikáció a S fázisban -Állati sejtben kulcsregulációs pont a G 1 -növényi sejt kiléphet a proliferációs ciklusból -két kontroll pont van a ciklusban: a DNS replikáció iniciálása és mitózis iniciálása : G 1 és G 2 -poliploidia: DNS replikáció mitózis és citokinézis nélkül S

A sejtosztódás szabályozása citokinin Cdc 25 Cdk Cyc. D 3 M Cdk G 2 G 1 SS Cdc 25= foszfatáz Cdk = ciklin dependens kináz Cyc. D 3 Cdk R E 2 F Rb Rb ICK 1 Cdk ABA Auxin Citokinin GA Cyc. D 3 = ciklin D 3 gén E 2 F = elongációs faktor Rb = retinoblasztóma fehérje ICK= ciklin függő kináz inhibitor

Fejlődésélettani hatások • Organogenezis szabályozása • Sejtmegnyúlás serkentése (sziklevelek) • Serkentik a kloroplasztiszok érését (intracelluláris morfogenezis) • Jelzik a növény N-ellátottságát • Szabályozzák az öregedést • Tápanyageloszlás (sink-source viszonyok)

Vegetatív szervek organogenezise inokulum IES (mg/l) Kinetin (mg/l) kallusz gyökér hajtás 3 3 0. 03 0. 2 0. 02 1 nem növekszik 0 0. 2

A nitrogén ellátottság hatása

A nitrogén ellátottság hatása

A nitrogén ellátottság hatása

A nitrogén ellátottság hatása

Az öregedés szabályozása Tápanyageloszlás kinetin A fiatal B öreg C - Radioaktív aminosavat a jobb levélfélre helyezték ( - Leképezés: autoradiogram kinetin D )

A citokinin jelátvitel modellje

A citokinin jelátvitel modellje

A citokinin jelátvitel modellje

A citokinin jelátvitel modellje citokinin 1. Citokinin receptor (AHK, CRE 1) érzékeli a jelet és foszforilálja a foszfotranszfer CRE 1 His kináz fehérjét (AHP) 2. A foszfo-AHP a sejtmagba jut és átadja a foszfátot a Btípusú válaszregulátornak (type-B ARR) 3. A foszforilált B-válasz regulátor aktiválja az A típusú válaszregulátor gének (type. A ARR) transzkripcióját 4. Az A-ARR akkumulálódik és negatív feedback révén represszálja az kört. CHASE PM Jelátvétel Foszforiláció Foszfotranszfer protein (AHP) Effektorok Válaszregulátor-B Válaszregulátor-A effektorok m. RNS transzkripció fény

A citokinin jelátvivők expressziós mintázata

Citokininek - máshol Taphrina sp. (boszorkányseprő)

Citokininek - máshol Pseudomonas savastanoi

Citokininek - máshol Rhodococcus fascians

Citokininek - máshol Stigmella aceris

Citokininek - máshol Stigmella tiliae

Citokininek - máshol Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens: tumoros növekedés

Protoplaszt-transzformációból nyert kallusz

Az A. tumefaciens által termelt opinok

Az Agrobacterium transzformáció Növényi sejt Agrobacterium Ti-plazmid genom sebzési fenolok sejtmag vir gének indukciója kivágott egyszálú T-DNS integráció vir fehérje vir fehérjék

Az Agrobacterium transzformáció +

A tumor indukáló Ti-plazmid T-DNS citokinin auxin opin bal és jobb „border” Ti-plazmid opin hasznosítás Vir gének Ori replikációs startpont

Agrobacterium Ti-plazmid mutánsok Részlegesen differenciálódott tumor: teratóma • Auxin deficiens: „shooty” mutáns (csak hajtáskezdemények) • Zeatin deficiens: „rooty mutáns (csak gyökérdifferenciálódás) – (ld. előbb: vegetatív szervek organogenezise)

A Ti-plazmidból kifejlesztett bináris transzformációs vektor konstrukció hasítóhely promóter bal T-DNS jobb border szelekciós marker E. coli ori A. tumef. ori ÜRES VEKTOR KÉSZ VEKTOR

Köszönöm a figyelmet!