Cintique et stochiomtrie A Garnier GCH2103 A2010 Cintique

Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cinétique et stochiométrie l l l Définition Les termes de base Les modes d’opération Les relations de base Détermination théorique Détermination expérimentale – – Taux initiaux Cuvée Chemostat Stop flow

Croissance cellulaire - variables X S P Taux de variation (kg/(m 3. s) Taux de production /consommation d. X/dt d. S/dt d. P/dt rx rs rp Taux spécifique (kg/(kg. s) Rendement (kg/kg) = rx/X qs= -rs/X qp= r. P/X Yx/s = rx/rs = /qp Yp/x, Yp/s

Mode d’opération l Système fermé: cuvée (batch) • Aucune entrée ou sortie • Régime transitoire • d. X/dt = r. X, d. S/dt = r. S • À t = 0, X = X 0, S = S 0

Cuvée alimentée (Fed-batch) F(t), Sin • Alimentation seulement • Régime transitoire • À t = 0, V= V 0, X= X 0, S= S 0 • F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S 0=Sc V, X, S • Si S est constant, le sera aussi, = c

Chemostat (continu, CSTR) F, Sin • Une entrée, une sortie • Mélange idéal: Xout = X, Sout = S, Pout = P F, S, X, P V, X, S, P • Après une période initiale d’adaptation, ce système atteindra un régime permanent: V= cst, X= cst, S= cst, P= cst

Chemostat avec recirculation F F(1+w) V, X Fc, Xc Fex, Xx w. F, Xx Bioréacteur Décanteur • Permet de concentrer les cellules dans le bioréacteur • Permet de repousser le lavage • Développement pour X seulement

Croissance cellulaire –type de modèles STRUCTURÉ/ SÉGRÉGÉ NONSTRUCTURÉ NONSÉGRÉGÉ + simple STRUCTURÉ SÉGRÉGÉ Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulaires Ségrégé: Tient compte d’une distribution de population

Modèles de croissance l Du plus simple au plus compliqué – Exponentiel (ordre 0!!) Linéaire (logistique) – Monod – Autres – l l Phénomènes connexes – Maintenance – Mortalité Production – Luedeking-Piret combiné aux différents modèles

Modèle enzymatique - Monod -Pour un système fermé (cuvée) en supposant YX/S constant: (1) (2) (3) -Une variable indépendante, 3 variables dépendantes, trois équations = Une solution!

Modèle de Monod l Équation 3 n’est peutêtre pas nécessaire: Xmax-X = Yx/s * S Alors:

Modèle de Monod

Modèle de Monod Sachant que:

Modèle de Monod Données max= 1 Ks= 5 Yx/s= 0, 5 So= 20 Xo= 0, 1 S = (Xmax-X)/Yx/s

Détermination théorique l Cinétique… l Rendement: modèles structurés (stochiométriques et autres)

Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire Lipides Acides gras glycerol [C 6 H 12 O 6]n C 6 H 12 O 6 Acides nucléiques NADH ADP O 2 G 3 P lactate éthanol pyruvate Acétyl-Co. A purines pyrimidines Ac. aminés NAD+ ATP H 2 O protéines Chaîne respiratoire Cycle de Krebs Le catabolisme génère de l’ATP et du NADH Modèle stochiométrique (cliquez ici)

Autres valeurs du coefficient de rendement (Bailey&Ollis, Mc. Graw-Hill, 1986)

Détermination expérimentale l Coefficient de rendement l Cinétique – – Taux initiaux Stop-flow Cuvée Chemostat

Détermination expérimentale du coefficient de rendement - YX/S constant Données max= 1 Ks= 5 Yx/s= 0, 5 So= 20 Xo= 0, 1 S = (Xmax-X)/Yx/s

Estimation des rendements en cuvée Avec des données de t, X, S, on peut calculer, Yx/s par un graphe de X vs S: Ici, Yx/s = 0, 5

Effet de maintenance l S = S(croissance) + S(maintenance) l r. S = 1/YG* r. X + m * X l qs = 1/YG* + m l 1/Yx/s = qs/ = 1/YG + m/

Effet de maintenance l 1/Yx/s = qs/ = 1/YG + m/

Effet de mortalité l Le taux de mortalité cellulaire: rd = - kd*X où kd=cste l Donc en cuvée: d. X/dt = *X – kd*X = ( – kd)*X En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée

Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et le rendement glutamine GLUCOSE OU glucose PYRUVATE lactate pyruvate NH 3 glutamate TCA cycle, resp. chain GLUTAMATE NH 3 GLUTAMINE -Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng. , 44: 808 -818, 1994 (Hybridoma)

Détermination de la cinétique – Taux initiaux Évaluation de qglc, qgln, qlact et q. NH 3

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux arrêté (Stopped-flow): Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés. Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop » .

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Moteur Réactif 1 Réactif 2 Mélangeur Lumière Détection Temps mort : Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange) De l’ordre de 1 milliseconde. Moteur

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de : Ø Photodiodes Ø Dichroïsme circulaire Ø Tube photomultiplicateur Ø Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3, 5 millisecondes)

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux étanché (Quenched-flow) : Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires. Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux étanché (Quenched-flow) : Types d’étanchage : Ø Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1 M) Ø Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Moteur Réactif 1 Réactif 2 Mélangeur Agent étanchant Mélangeur Chambre réactionnelle linéaire Récupération des fractions Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Les fractions recueillies sont analysées par des méthodes non-optiques : Ø Spectroscopie de masse « en ligne » Ø Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse Ø Électrophorèse sur gel, Ø Comptage à scintillation, Ø etc…

Estimation des paramètres de Monod en cuvée l Puis on peut reformuler l’équation de X pour isoler des termes reliés linéairement: ÷t Y = b + m X ÷t

Monod – estimation des paramètres max = 1 m = 0, 2475 = Ks*Yx/s/Xmax Ks= 0, 2475*10, 1/0, 5 Ks= 5

Utilisation du Chemostat pour la détermination des paramètres cinétiques l Relation cinétique, par exemple Monod:

Prochain labo: Cuvée alimentée (Fed-batch) F(t), Sin • Alimentation seulement • Régime transitoire • À t = 0, V= V 0, X= X 0, S= S 0 • F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S 0=Sc V, X, S • Si S est constant, le sera aussi, = c

Cuvée alimentée (Fed-batch) l 3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle de ce système: F ….

Cuvée alimentée (Fed-batch)

Cuvée alimentée (Fed-batch) 0 F

Cuvée alimentée (Fed-batch)