Chromatographie Physikalischchemische Trennmethoden bei denen die Stofftrennung auf

Chromatographie Physikalisch-chemische Trennmethoden, bei denen die Stofftrennung auf einer unterschiedlichen Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase beruhen.

Was ist Chromatographie? Trennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen • Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und darin durch eine stationäre Phase transportiert. • Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen. • Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede trennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.

Mechanismen der Trennung 1. Adsorptionsgleichgewicht (feste stationäre Phase, flüßige mobile Phase): z. B. HIC, Adsorptionschromatographie. 2. Verteilungsgleichgewicht (flüßige stationäre Phase, flüßige oder gasförmige mobile Phase): z. B. Verteilungschrom. , RP, GLC 3. Ionenaustauschgleichgewicht (Ionentauscher als stationäre Phase, Elektrolyt als mobile Phase): z. B. Ionentauschchrom. 4. Gleichgewicht zwischen einer mobilen und einer stagnierenden flüßigen Phase : z. B. Gelpermeation, SEC 5. Gleichgewicht zwischen einem immobilisierten Liganden und einer flüßigen mobilen Phase: z. B. Affinitätschromatog.

Verteilungskoeffizient z Der Verteilungskoeffizient Kd beschreibt wie sich eine Substanz zwischen zwei (nicht mischbaren) Phasen verteilt. z Kd = Konzentration in Phase A Konzentration in Phase B

Kapazitätsfaktor z Der Kapazitätsfaktor beschreibt die effektive Verteilung. Er besagt welche Menge an Substanz sich in einer Phase befindet. Anzahl Mol in stationärer Phase z Kx = Anzahl Mol in mobiler Phase z Damit ist der Kapazitätsfaktor von der Menge der Phasen abhängig. z. B. : Kd=1 und stat. Phase : mob. Phase = 10 : 1 10 x mehr in A als in B

Die Trennung I S D C

Das Chromatogramm Lösungsmittel-Peak Detektor. Signal Basislinie Zeit Programmstart

Der Peak t. R 2 t. R 1 Detektorsignal t. M h wh Kapazitätsfaktor w t. M t. R 1 z t. R. . . Retentionszeit z t‘R. . . Netto-Retentionszeit z t. M. . . Totzeit z w. . . Basisbreite t. R 2 Zeit z k‘ = t. R - t M t. M = t‘R t. M

Relative Retention (Trennfaktor) Trennfaktor a ist ein Maß für die Selektivität des Systems a= k 2‘ k 1‘ a wird durch die Eigenschaften der mobilen und stationären Phase bestimmt. z k‘ ist von der Säulenlänge und von der Geschwindigkeit der mobilen Phase unabhängig! z Peaks werden nur getrennt wenn k 1‘ und k 2‘ unterschiedlich sind.

Die Auflösung z Die Auflösung R zweier benachbarter Peaks A + B ist definiert als: R= 2 (t. RB - t. RA) w. A + w B R = 0. 5 R = 0. 8 R = 1. 5

Trennstufenmodell t. R 2 N = 16. ( w ) Trennstufen (theoretische Böden) L H= Höhenequivalent eines theor. Bodens (HETP) N Zahl der theoretischen Trennstufen N gibt an, wie oft eine Gleichgewichtseinstellung entlang der Säule erfolgen kann. Das Höhenequivalent gibt an, auf welcher Strecke (Länge) sich das Gleichgewicht einmal einstellen kann.

Beinflussung der Auflösung 1 + k‘ R = 0. 25. (a - 1). N. ( k‘ ) Leistungsfähigkeit der Trennsäule Selektivität des Systems „Wechselwirkungen“ Stärke des Elutionsmittel

Verbesserung der Auflösung N und k' bleiben gleich a 1. (a) Relative Retention Änderung der station. a und k' bleiben gleich N Phase Wechselwirkungen der mob. 2. N und a bleiben gleich k' Trennstufenzahl (N) bessere oder längere Säule (2 L 1. 4 R); v von mobil. Phase

Quantifizierung z. Etablierung der Basislinie z. Messung der Peak-Flächen oder -Höhen z. Einfache Kalibration z. Gebrauch von Internen Standards

Die Basislinie ist nicht (immer) eben! „Drift“ der Basislinie „Tailing“ oder „Fronting“ spät eluierende Peaks schlecht getrennte Peaks Säulenbluten

Peak-Fläche und Peak-Höhe z Abschätzung der Peak-Fläche A über die Breite auf halber Höhe (wh = b 0. 5) A = wh. h z Mit Integratoren oder Computerprogrammen errechenbar. Erkennung des Peak-Anfangs und -Endes wichtig.

Einfache Kalibration z Für jede Substanz wird eine Kalibrationskurve erstellt. Kalibration sollte mindestens 4 Konzentrationen beinhalten und mit jeder neuen Charge an Proben neu erstellt werden!

Kalibration mit internem Standard Flächen-Quotient FQ 1 = Fläche Std 1 1, 05 = = 1. 05 Fläche IStd 1 1, 00 FQ 2 = Fläche Std 1 1, 62 = = 1. 91 Fläche IStd 2 0, 85 Fläche Std 1 2, 98 FQ 3 = = = 2. 81 Fläche IStd 3 1, 03 PQ 1 = Fläche Probe 1, 35 = = 1, 61 Fläche Istd P 0, 84 entspricht 1. 64 Konz

Klassifikation der Chromatographie z. Planare Chromatographie: Dünnschichtchromatographie Papierchromatographie z. Säulenchromatogrphie: Flüssigchromatographie (LC, HPLC, IEC, GPC) Gaschromatographie (GLC, GSC)

HPLC & GC Methode Stationäre Phase (A) HPLC LSC IEC SEC flüssig, adsorb. Feststoff (z. B. Silikagel) Ionentauscher Polymer mit Poren Verteilung Adsorption Ionenaustausch Molekülgröße flüssig, adsorb. Feststoff (a) Feststoff (b) Molekularsieb Verteilung Adsorption Molekülgröße (B) GC GLC GSC Prinzip