Chromatin Immunoprecipitation Transcription factor binding site Chromatin Immunoprecipitation
Chromatin Immunoprecipitation를 통한 Transcription factor binding site 분석 분자유전학 연구실 남제현
실험 목적 Chromatin Immunoprecipitation; Ch. IP -To determine whether a protein binds a particular DNA site in a living cell
실험 배경 및 원리 Transcription Factor -Protein that binds to specific DNA sequences, thereby controlling the rate of transcription of genetic information from DNA to m. RNA
실험 배경 및 원리 Gene Regulation in Eukaryotes Special transcription factor
실험 배경 및 원리 Tissue specific transcription factor
실험 배경 및 원리 What is Chromatin? <The function of chromatin> -Package DNA to enable it to fit in the cell, strengthen DNA to assist with mitosis and meiosis, and serve as a mechanism to control gene expression, DNA repair, and DNA replication. -Histone proteins play an important role in the regulation of these processes. (acetylation, methylation, phosphorylation and etc. . )
실험 배경 및 원리 Chromatin Immunoprecipitation (Ch. IP) The principle of Ch. IP : -The selective enrichment of a chromatin fraction containing a special protein of interest. - Antibodies that recognize a protein or protein modification of interest can be used to determine the relative abundance of that antigen. - Basically, if you’re looking to observe your protein of interest and its interactions with the genome in its ‘natural’ state Ch. IP is a great choice.
실험 개요 Ch. IP is extremely versatile Chip-on-chip Chip-seq
실험 개요 <Overview of Ch. IP assay> step 1. Fixation을 통해 DNA-protein crosslink를 얻어내고 Sonication 하여 DNA를 일정한 크기로 끊어준다. step 2. step 3. Immunoprecipitation을 통해 target protein을 침전시켜 얻는다. Purification된 DNA를 q. PCR하여 transcription factor가 target gene에 binding 하는지 알아본다.
실험 개요 1. Fixation MYC (cross-linking) Promoter 2. Cell collection (using centrifuge 240 g, 5 min) 3. Cell lysis (Lysis Buffer 200 u. L) 4. Sonication (Using sonicator: 10 sec, 10 times) MYC Promoter NPM 1
실험 개요 ※Preclear (Using protein agarose A/G beads) MYC protein Promoter Spin down and throw beads away Get supernatant MYC M Y C protein MYC M Y C protei n
실험 개요 5. Immunoprecipitation (Put MYC antibody) MYC Promoter (Put protein agarose A/G beads) MYC MYC MYC (Get Protein-Antibody-Beads complex) MYC
실험 개요 6. Reverse cross-link (Using Na. Cl and Proteinase K) MYC Promoter MYC NPM 1 Promoter 7. Purification (Using PCR purification kit) 8. Real-time PCR
실험 방법 Before Ch. IP assay Program을 이용한 transcription factor 검색(Target prediction) Transcription Factor Binding Prediction software Put NPM 1 Promoter sequence Find transcription factor Transfac aac. CATGTGgtc
실험 방법 1일차. Live cell을 Cross-linking한 후, lysis 된 샘플을 Sonication하 고, sonication된 DNA단편의 크기(size)를 DNA gel electrophoresis를 통해 확인한다. 1000 bp 500 bp 1 kbp부근에서 detection 됨 500 bp 부근에서 detection 됨
실험 방법 2일차. Immunoprecipitation을 통해 target protein을 침전시킨다. 이 후 reverse cross-linking을 통해 DNA만 얻어낸다. 그 이후 q. PCR을 진 행하여 NPM 1 gene을 증폭시킨다. NPM 1
실험 방법 3일차. Purification 된 DNA sample을 이용하여 Real-time PCR을 진행한다. -Percent Input 또는 Fold enrichment calculation을 통해 transcription factor가 target gene에 binding하는지 알아본다. 14 Fold Enrichment 12 10 8 normal Ig. G 6 MYC 4 2 0 NPM 1
실험 재료 <실험 1주차 실험재료> 1. 1 x 10^7 cells 2. 1% 포름알데하이드 272 u. L for fixation. 3. Glycine(stock 1. 25 M) 1. 15 m. L for stop fixation. 4. Centrifuge 5. PBS 1 m. L for wash 6. Cell lysis buffer (200 ul) 7. Nuclei lysis buffer(500 ul) 8. IP dilution buffer(2. 5 ml) 9. Sonicator 10. DNA dye와 DNA gel electrophoresis 기계 11. Protein A/G agarose Beads
실험 방법 1% Formaldehyde를 이용한 Cross linking 및 cell lysis 과정 NPM 1 1. 1% formaldehyde 272 u. L를 1 x 10^7(1 천만개)의 cell이 담겨있는 tube에 넣고 10분간 상온에서 기다린다. 2. Tube에 Glycine(1. 25 M)을 1. 15 m. L 넣고 5분간 기다린다. 3. Centrifuge를 이용하여 240 g에서 5분간 돌린 후 Pellet만 남긴 후, PBS를 이용하 여 Cell을 washing해준다.
실험 방법 Sonicator를 이용한 sonication 과정 8. IP dilution buffer를 이용해 total volume을 3 m. L로 맞춰준다. 9. Sonicator를 이용하여 (Power는 level 8 로 고정) sonication을 진행한다. (10 sec sonication, 50 sec stop)총 6회 10. Centrifuge를 이용하여 13, 000 rpm에 서 10분간 돌려준다.
실험 방법 DNA gel electrophoresis를 통해 sonication 정도를 확인 1. Sonication을 진행한 sample에서 20 u. L를 따낸다. 2. Loading dye 3 u. L 를 넣어준다. 3. DNA agarose gel에 loading한다. 4. DNA gel imager를 통해 band를 확인한다. 500 bp 부근에서 detection 됨
실험 방법 Immunoprecipitation: Preclear 과정 1. Protein agarose A/G beads 15 u. L 를 Sample 에 넣어준다. 2. 1 Hrs , 4℃ rotor 에 올려둔다. 3. Centrifuge를 이용하여 beads 를 down시킨 후, 상층액을 얻어낸다. 4. E-tube 에 각각 250 u. L씩 나눠준다. 5. Normal Ig. G antibody와 MYC antibody를 각각 5 u. L씩 넣어준다.
1주차 결과 1조 3000 bps 1000 bps 2조 3조 4조 5조 6조
실험 계획(2주차) -Sonication을 통해 얻은 Sample(1주차) 을 이용하여 Immunoprecipitation 한다. -Immunoprecipitation을 한 후, Nacl를 이용해 Reverse Crosslink 시킨다. -Proteinase K를 이용하여 DNA에 붙어있는 Antibody를 제거한다.
실험 방법 IP sample 준비 10% Input 30 u. L Normal Ig. G 300 u. L MYC antibody 300 u. L
실험 방법 10% Input sample에 서 NPM 1 유전자 100개 10% Input 30 u. L MYC antibody 300 u. L MYC antibody를 이 용한 IP 에서 NPM 1 유전자 20개
실험 방법 Calculation by Band thickness 1% 두께 0. 7 두께 0. 4 1% Input Normal Ig. G MYC antibody : 1% Input Band 의 두께 = X% : Myc Antibody Band 의 두께
실험 재료 <실험 2주차 실험재료> 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Protein A/G agarose Beads Na. Cl 5 M IP wash buffer 1 + IP wash buffer 2 IP elution buffer Proteinase K (10 mg/m. L) PCR purification kit Realtime PCR mix
실험 방법 Calculation by % Input NPM 1 STEP 1 Adjusted input to 100% Input (1%) Raw Ct Ct value - 6. 644 32. 644 26 % Input STEP 2 Percent input Average Ct Normal MYC ig. G antibody 100*2^(Adjuste d input –Ct(IP)) Adjusted input 26 Ig. G 34 0. 39% Myc antibody 29 12. 5%
실험 방법 Immunoprecipitation and DNA reverse cross-linking 1. Protein agarose A/G beads 10 u. L를 Sample 에 넣 어준다. 2. 1 Hrs , 4℃ rotator 에 올려둔다. 3. Centrifuge를 이용하여 beads 를 down시킨 후 Pellet을 얻어낸다. 4. IP wash buffer 1 300 u. L로 1회 washing한다. 5. IP wash buffer 2 300 u. L로 1회 washing 한다. 6. IP elution buffer 100 u. L 를 넣은 후, rotator에 5분 간 Incubation 한다. 7. IP elution buffer 200 u. L+ Na. Cl 15 u. L를 추가로 넣 어준다. 마지막으로 65 ℃ 에서 15분간 Incubation 한다.
실험 방법 Proteinase K 처리 및 DNA purification 1. Sample에 Proteinase K 5 u. L를 넣어준 다. 2. 10 min , 54℃ heat block에 넣어 둔다. NPM 1 3. PCR purification kit를 이용하여 DNA 를 purification 한다.
실험 방법 Real time PCR을 통한 NPM 1 expression 확인 1. 준비된 Real-time PCR sample mix에 DNA sample 10 u. L를 넣어준다. 2. Real time PCR machine을 이용해 real time PCR을 진행한다. 3. 결과를 분석한다.
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