Chemotaxis von Eukaryonten Vorlesung System Biophysik 28 November

Chemotaxis von Eukaryonten Vorlesung System Biophysik 28. November 2008

Chemotaxis in Dictyostelium Discoideum The dictyostelids are a group of cellular slime moulds. When food (normally bacteria) is readily available they take the form of individual amoebae, which feed and divide normally. However, when the food supply is exhausted, they aggregate to form a multicellular assembly, called a pseudoplasmodium or slug (not to be confused with slug the animal). The slug has a definite anterior and posterior, responds to light and temperature gradients, and has the ability to migrate. Under the correct circumstances the slug matures forming a fruiting body with a stalk supporting one or more balls of spores. These spores are inactive cells protected by resistant cell walls, and become new amoebae once food is available. In Acytostelium, the fruiting body is supported by a stalk composed of cellulose, but in other dictyostelids the stalk is composed of cells, sometimes taking up the majority of the original amoebae. With a few exceptions, these cells die during stalk formation, and there is a definite correspondence between parts of the slug and parts of the fruiting body. Aggregation of amoebae generally takes place in converging streams. The amoebae move using filose pseudopods, and are attracted to chemicals produced by other amoebae. In Dictyostelium, aggregation is signalled by c. AMP, but others use different chemicals. Dictyostelium has been used as a model organism in molecular biology and genetics, and is studied as an example of cell communication, differentiation, and programmed cell death. From: en. Wikipedia. org

Der Schleimpilz Dictyostelium Discoideum

Entwicklungszyklus von D. Discoideum Wachstumsphase I Hungerphase II Differenzierungsphase III

Der Lebenszyklus von Didi Phase I: Die Amöben leben (auf Agarplatten) unter paradiesischen Bedingungen (gutes Vehältnis Nahrung zu Populationsdichte) als Einzeller und vermehren sich durch Teilung. Diese Phase besteht aus zwei Teilen: Einem Bereich exponentiellen Wachstums und einem stationären Zustand mit konstanter Zellzahl. Phase II: Erschöpfung des Nahrungsvorrats führt nach acht Stunden zu einer kollektiven Wanderung der Zellen zu statistisch verteilten Zentren aufgrund von kollektiver Chemotaxis. Wir werden unten sehen, daß dies die Folge einer Steuerung der Zellen durch die Signalsubstanz c AMP ist. Phase III: Differenzierung der Zellen und Aufbau eines Schleimpilzes. Drei Typen von Zellen entstehen: Teilungsfähige Sporenzellen, stabilisierende Stielzellen und Hüllenzellen des Sporenkopfes.

Chemotaxis in Dictyostelium Discoideum

Dicties bewegen sich „zufällig“ ohne c AMP Stimulation

Eukaryotische Chemotaxis • Richtungsdetektion (directional sensing) Lokale Anregung globale Inhibition • Polarisation (polarization) Lipidvermittelte Signalübertragung • Fortbewegung (locomotion) Aktinpolymerisation

Formen der Signalübertragung

Der Signalstoff c AMP Zyklisches Adenosinmonophosphat 1) c-AMP : die Signalsubstanz 2) ATP : fungiert als Energielieferant und als Substrat für die c AMP–Produktion 3) Adenylatzyklase : Enzym, das ATP in c AMP transformiert 4) c-AMP–Phosphodiesterase : ein Enzym, das c AMP abbaut

Gerichtete Dicties Bewegung durch einen c AMP Gradienten

G Protein gekoppelte Rezeptoren leiten ihr Signal intrazellulär über trimere G Proteine weiter, die wiederum die Konzentration intrazelluläre Mediatoren (Botenmoleküle „second messenger“) verändern.

Rezeptoraktivierung koppelt an die Adenylylcyclase (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) Bild

Biochemisches Netzwerk der Zellaggregation (Laub&Loomis, 1998) Dictyostelium cells accumulate a high affinity cell surface c. AMP receptor (CAR 1) that is a member of the G protein –linked family of receptors. When CAR 1 binds c. AMP, the signal is transduced via a G protein to activation of adenylyl cyclase (ACA), the membrane associated enzyme that catalyzes the formation of c. AMP from ATP. Some fraction of this c. AMP is then secreted into the environment, while the rest remains within the cell. Binding of external c. AMP to CAR 1 thus initiates a positive feedback loop in which external c. AMP binding CAR 1 activates ACA, leading to the production of more external c. AMP.

Zell Aggregation durch c AMP Stimulus Aggregation of D. discoideum ameobae towards c. AMP, lower magnification. From R. Firtel, University of California, San Diego

Dictyostlium Discoideum as Model System for Chemotaxis to c. AMP is part of a program of differentiation where free living amoebae aggregate to form a multicellular organism. During aggregation the cells orient and migrate directionally toward selforganizing gradients of extracellular c. AMP. Studies of these events in D. discoideum have led to the identification and localization of key molecules in chemotactic signaling pathways and to the basic mechanisms involved in chemotaxis. For instance, the discovery of a family of receptors, designated c. AR 1–c. AR 4, for the chemoattractant c. AMP provided the first evidence that chemotactic signaling occurs through seven helix receptors linked to heterotrimeric G proteins. The c. ARs couple to a specific G protein consisting of 2, one of eleven subunits, and a unique complex. A similar system operates in mammalian leukocytes, where twenty chemokine receptors couple principally to the inhibitory G protein, Gi. Additional elements of the pathway are also conserved: exposure of amoebae or leukocytes to chemoattractants results in increases in multiple second messengers, including PIs (phosphoinositides), c. AMP, c. GMP, IP 3, and Ca 2, and subsequent rearrangements in the cytoskeleton.

Modular view of the chemoattractant induced signaling pathway in Dictyostelium Peter N. Devreotes et al. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004. 20: 22

Signalübertragungsweg dictyostelium discoideum c. AMP + b g Ga b g PI 3 K* PIP 3 PIP 2 PTEN RAS Gradient Sensing pleckstrin homology domain PH CRAC Acetylcholin. Aktivierung Rac/Cdc 42 Polarisation - Actin polymerization

Imaging of PI 3 K and PTEN Peter N. Devreotes et al. Developmental Cell, Vol. 3, 469– 478, October, 2002,

Inositol Phospholipid Signalübertragung PIP 3 ist als Produkt der PI 3 Kinase ein Botenmolekül wie c. AMP. Im Unterschied zu c. AMP ist PIP 3 in der Memban lokalisiert und aktiviert weitere Signal Proteine an der Membranoberfläche durch Bindung an die Pleckstrin-Homologie-Domäne. PI 3 Kinase PH Domäne

PIP 3 acts as internal compass Cells expressing PH-Crac. GFP sense a gradient of c. AMP released from a micropipette. Work by Devreotes et al.

Quantitative Image Analysis (Molecular Biology of the Cell, 16, 676– 688 (2005) Tian Jin et. al. )

Die Inositol Phospholipid Signalübertragung PIP 3 PIP 2 PIP

Die Inositol Phospholipid Signalübertragung Gradient Sensing The ability to sense and respond to shallow gradients of extracellular signals is remarkably similar in Dictyostelium discoideum amoebae and mammalian leukocytes. Chemoattractant receptors and G proteins are fairly evenly distributed along the cell surface. Receptor occupancy generates local excitatory and global inhibitory processes that balance to control the chemotactic response. Uniform stimuli transiently recruit PI 3 Ks to, and release PTEN from, the plasma membrane, while gradients of chemoattractant cause the two enzymes to bind to the membrane at the front and back of the cell, respectively. Counteracting signals from the upstream elements of the pathway converge to regulate the key enzymes of PI metabolism, localize these lipids, and direct pseudopod formation.

Regulation der Aktin Polarisation

PIP 3 dynamics: temporal and gradient Temporal Signal of PH CRAC GFP Kinetic analysis of the translocation from the cytoplasm to the plasma membrane of GFP tagged CRAC (Cytosolic Regulator of Adenylyl Cyclase a PH domain containing protein) in response to a uniform increase in chemoattractant concentration. Frames were taken every 2 seconds. The chemoattractant was added just before the cell goes out of focus. From C. A. Parent and P. N. Devreotes, Johns Hopkins Medical Institutions. PH CRAC GFP in a c. AMP gradient Confocal image of GFP tagged CRAC in living amoebae undergoing chemotaxis. CRAC GFP specifically translocates to the leading edge of newly elicited pseudopods. The chemoattractant gradient is established using a micropipet located near the upper right corner of the frame. Images were captured every 5 seconds. From C. A. Parent and P. N. Devreotes, Johns Hopkins Medical Institutions. dictybase. org

Actin Polymerisation an der Front

Polarisation Formveränderung durch Aktivierung des Zytoskletts Review by Weiner

Biochemisches Netzwerk der Zellaggregation (Laub&Loomis, 1998) Negative feedback comes from PKA, inhibiting CAR 1. However this positive feedback does not continue unabated. Two to three minutes after the stimulation of cells with external c. AMP and the activation of ACA, there is a rapid 5 - to 10 -fold reduction in the affinity of CAR 1 to c. AMP and a consequent reduction in ACA activity. CAR 1 returns to its original unphosphorylated and high affinity state shortly after the removal of external c. AMP, indicating that the phosphates are rapidly removed by a phosphatase. When c. AMP is removed, the modification of CAR 1 is reversed, and CAR 1 is again able to bind c. AMP with high affinity. Thus, ligand binding oscillates in response to the levels of external c. AMP.

Modelle zur Erklärung von Chemotaxis Local excitation global inhibition

Die chemotaktische Polarisation ist persistent from Parent et al.

Lokale Aktivierung Globale Unterdrückung Drei Zustandsmodell von Rappel et al. (2002) Die Membran kann die Zustände Q (quiescent), I (inhibited) und A (activated) annehmen. Die Inhibierung wird durch c. GMP vermittelt

An und Aus Schalten der c AMP Stimulation

Modellierung der intrazellulären Botenstoffverteilung Lineare. Ratengleichungen =Zustandsdichten c=conc. (c. AMP) g=conc. (c. GMP) q: quiescent, a: activated, i: inhibited Diffusionsgleichungen Randbedingungen

Num. Lösung der Diffusionsgleichungen

Simulationsergebnisse

Zellbeweglichkeit ist durch Aktin getrieben Three steps of locomotion: Protrusion Adhesion Retraction © Firtel

Eucaryotic Chemotaxis : localized response to chemoattractant Figures : Firtel Gerisch

Cell Aggregation Time lapse video of small group of aggregating cells. Interval between movement steps is 6 minute. From P. Devreotes, Johns Hopkins Medical Institutions.

c AMP Waves in Aggregating Cells Core of a spiral wave in aggregating D. discoideum cells. Time between images is 10 seconds. From F. Siegert and C. J. Weijer, J. Cell Sci. 93, 325 335 (1989).

Video Zellaggregation

Biochemisches Netzwerk der Zellaggregation (Laub&Loomis, 1998) a rapid positive feedback activation of CAR 1, via ACA, followed by a delayed negative feedback inhibition of CAR 1, via PKA, produces the observed oscillations in Dictyostelium cells developed for 4 h.

Dark field waves of D. discoideum cells on caffeine agar. Time between images is 36 seconds. From F. Siegert and C. J. Weijer, J. Cell Sci. 93, 325 335 (1989).

Autokatalytische Oszillatoren

Der Van der Pol Oszillator Van der Pol Gleichung Klassisches Modell eines autokatalytischen Oszillators mit F(t)=e(x 2 1). Ein äquivalentes Gleichungssystem in Normalform ist:

Lösungen der Van der Pol Gleichung Das System verhält sich als selbsterregender Oszillator x y x x

Die allosterische Kontrolle der Enzymaktivität Die über die allosterische Steuerung der c AMP Produktion (Rezeptor Adenylatzyklase Komplex) eingeführte Funktion F(Pex, S) führt zu einer starken Rückkopplung des c AMP auf seine Reproduktion. F(S) Pex S L ist die sogenannte allosterische Konstante und ist gleich dem Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation k 1 und der Assoziation k 2 des Effektors: L = k 1 / k 2 (siehe z. B. Prigogine and Nicholis Ch 14. 3, Fig. 14. 3

Wiederholung

Modell nach Goldbeter&Segel Der Rezeptor – Adenylat Komplex wird als allosterisches Enzym modelliert mit nicht linearer Kooperativität F(Pex, S) S : Substrat Pin : Produkt innen Pex : Produkt aussen (1) (2) v: Zufluß von Substrat (ATP) s: Maß für die Aktivität des Enzyms kt: Translokationsrate h: Verdünnungsfaktor (3) KP, KS sind Gleichgewichtskonstanten; und zwar ist KP die Dissoziationskonstante des c AMP–Rezeptor–Komplexes und KS die Michaelis Menton Konstante (KS = [ES] / [E] [S]) des Systems ATP–Adenylatzyklase.

Näherung der Goldbeter Gleichung Wie bei selektiven Rezeptor Hormon Bindungen üblich, ist die Dissoziations konstante KP sehr klein. Üblicherweise ist KP 10 9 Mol/Liter. Dagegen ist KS (= Maß für die Substratkonzentration (S), bei der die Hälfte der Bindungsstellen besetzt ist) viel größer; typischerweise KS 10 4 Mol/Liter. Daher variiert der intrazelluläre c AMP–Spiegel sehr langsam und l = KS s / KP h k

Lösungen des Goldbeter Models Fixpunkt: Stationäre Lösungen: d. Pex/dt=0 d. S/dt=0 A Trajektorie (a): Einmalige Erregung, das System kehrt zum Fixpunkt (Ruhezustand) zurück. B Liegt der Arbeitspunkt im instabilen Bereich zwischen A und D (neg. Steigung) treten selbsterregte Oszillationen auf.

Beobachtung : Spontane c AMP Oszillationen Die optische Dichte homogenisierte Zellsuspensionen von Dictyostelium zeigt eine kollektive Veränderung der Zellen an, die mit dem Ausstoß von c AMP verbunden ist. [G. Gerisch und B. Hess, 1973] Ständig gerührte Zellsuspensionen (t>6 h) benehmen sich als autonome Oszillatoren und senden mit einer Periode von acht Minuten c AMP– Signale aus. Auf den Empfang eines c AMP– Impulses antwortet die Zelle nach einer Verzögerung von ein bis zwei Minuten mit der Aussendung eines 100 fach verstärkten c AMP–Impulses.

Time lapse video of monolayer of aggregating cells filmed through a dark field macroscope. White bands represent chemotactically oriented cells. Period of wave initiation is 6 minutes. From P. Devreotes, Johns Hopkins Medical Institutions

Biochemisches Netzwerk der Zellaggregation (Laub&Loomis, 1998)

Wahl der kinetischen Konstanten und Simulationsergebnisse gemessen geschätzt

Einfluss eines c AMP Pulses auf die Phase Zugabe von c AMP (schwarzer Peak) hat praktisch keinen Effekt auf die Phase in der ACA Hochphase. Zugabe von c AMP (schwarzer Peak) in einer Niedrigphase von ACA und internem c AMP läßt den Zyklus um fast eine halbe Periode vorwärtsspringen. In beiden Fällen wurde der c AMP Zuwachs schnell durch die Phosphodiesterase abgebaut. Das Netzwerk führt zur Synchronisierung der Zellen.

Phase Shift by adding c. AMP Simulation Phase at which c. AMP was added Experiment Phase at which c. AMP was added Adding c. AMP to an oscillating cell leads to no change if done at zero phase shift, but either delays the cell or advances the cell in ist cycle. As result, the cells synchronize within maximally 1 h. (Laub&Loomis, 1998)

Phase Shift synchronizes cell populations Uncoupled by external c. AMP Coupled by external c. AMP Synchronization in the computer model. If external c. AMP does not mix between cells (hypothetical control case), cells do not synchronize. But even two cells which oscillate at maximal phase difference, start to synchronize within 1 h. (Laub&Loomis, 1998)

Robustheit des biochemischen Netzwerks Die Frequenz der Oszillation hängt nur schwach von der Veränderung der kinetischen Konstanten ab. Zugabe von c AMP (schwarzer Peak) hat praktisch keinen Effekt auf die Phase wurde schnell durch die Phosphodiesterase abgebaut. . It has been argued that any biologically significant circuit that has survived selective surveillance must be robust in the face of random perturbations, and our circuit supports such an hypothesis (Barkai and Leibler, 1997). .

Die zyklische Phosphorylierung der Kinase ERK 2 Phospho ERK 2 läßt sich durch spezifische Phospho ERK 2 Antikörper mit Hife von Western Blot nachweisen. (Maeda et al. Science 2004)

Simulation der Aggregatbildung Zeitserie von 3000 Zellen: Die c AMP Konzentration ist durch Grauton angedeutet und läßt eine Spirale erkennen. E und (F) sind Seitenansichten von © und (D). In (D) sind alle Zellen in einem Aggregat versammelt und rotieren um die Längsachse. von T. Brettschneider, 1997

Die Theorie zellulärer Automaten Ein diskretes Reaktions Diffusions System Gekoppelte Felder mit jeweils einen von drei Zuständen : 0: Erholungsphase, 1: Ruhephase, 2: Angeregter Zustand Die Regeln : 0 1; 2 0; 1 1, wenn kein Nachbar in angeregtem Zustand 1 2, wenn mindestens ein Nachbar angeregt Start mit zufälliger Anfangskonfiguration

Simulationsergebnis einer einfachen Dynamik

Computermodell der Zellbewegung In einem 3 D Medium werden in jedem Voxel (i, j, k) die extrazelluläre c AMP Konzentration g(i, j, k)und die Anzahl Zellen N(i, j, k) betrachtet: Die Veränderung der extrazelluläre c AMP Konzentration folgt einer Reaktions Diffusionsgleichung und hängt von der Zelldichte N(i, j, k) und der zeitabhängigen intrazellulären c AMP Konzentration b ab: Die Beschreibung der Bewegung der Zellen enthält drei Komponenten: 1) Chemotaxis vc=k gradg 2) Zufallsbewegung 3) Bewegung auf Grund eines „Zelldrucks“ bei zu großer Zelldichte

Simulation der Aggregatbildung Zeitserie von 3000 Zellen: Die c AMP Konzentration ist durch Grauton angedeutet und läßt eine Spirale erkennen. E und (F) sind Seitenansichten von © und (D). In (D) sind alle Zellen in einem Aggregat versammelt und rotieren um die Längsachse. von T. Brettschneider, 1997