Champignons toxinognes et mycotoxicoses Patrick BOIRON Laboratoire de

Champignons toxinogènes et mycotoxicoses Patrick BOIRON Laboratoire de Mycologie, Faculté de Pharmacie, Lyon, France

Champignons induisant des manifestations cliniques chez l’homme Différences essentielles entre champignons • Vénéneux (toxiques) : mycétismes • Toxinogènes : mycotoxicoses • Pathogènes stricts mycoses • Opportunistes • Allergènes : allergies fongiques

Champignons sur les denrées alimentaires • Champignons « bénéfiques » : industries fromagères (Penicillium, Geotrichum) et viticoles (levures sauvages ou sélectionnées)

Champignons sur les denrées alimentaires • La contamination initiale des denrées alimentaires non soumises à stérilisation ou pasteurisation, par des spores de moisissures est inévitable

Champignons sur les denrées alimentaires • Champignons « indésirables » : moisissures (Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, etc. ) banales ou toxiques (Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Penicillium expansum, etc. )

Champignons sur les denrées alimentaires • Le développement des moisissures sur les denrées alimentaires peut conduire : • A une dépréciation de leur valeur nutritionnelle et une altération de leurs caractères organoleptiques, • A des risques pour le consommateur (animal ou homme) et le manipulateur : mycoses (Aspergillus fumigatus), allergies (foin moisi), mycotoxicoses

Mycotoxines • Métabolites secondaires de faible poids moléculaire

Mycotoxines • Fixées au niveau des spores ou excrétées dans le milieu contaminé (aliments, eau) toxicité potentielle ou réelle pour les hommes et les animaux par : • Inhalation • Ingestion • Plus rarement, par contact

Mycotoxines • Mycotoxines inhalées partiellement solubles dans l’eau pulmonaire des alvéoles : circulation générale troubles généraux respiratoires et/ou spécifiques d’organes (milieux professionnels industriels et agricoles ; domestique ? )

Mycotoxines • Les connaissances concernent surtout les mycotoxicoses par ingestion (population générale)

Conditions physico-chimiques de développement • Disponibilité en eau • Température • Composition gazeuse • Influence du substrat

Disponibilité en eau • Germination conditionnée par l’activité en eau (aw) dans la spore • Croissance du mycélium conditionnée par l’eau disponible dans le substrat • Classification en : • • Xérophiles : Aspergillus restrictus, A. glaucus, A. versicolor • Hygrophiles : Cladosporium, Fusarium, Mucorales Mésophiles : Aspergillus flavus, A. nidulans, A. fumigatus, Penicillium expansum, P. cyclopium

Température • Conditionne la compétitivité • Rôle prépondérant sur la croissance, le développement et la physiologie • Eventail très large (optima : 20 – 25°C) • Croissance / survie

Température • Cladosporium herbarum : croît à – 6°C et survit à – 20°C • Aspergillus flavus : survit à 35°C dans les tunnels de pâtes • Aspergillus fumigatus tolère 55°C • Byssochlamys germe après 10 min à 85°C • Ascospores de Neurospora germent après 20 min à 130°C (four de boulangerie)

Température Classification en : • Thermophiles : Byssochlamys, Aspergillus fumigatus, … • Thermotolérants : Aspergillus niger, … • Mésophiles : Penicillium chrysogenum, Aspergillus versicolor, … • Cryophiles : Cladosporium, Alternaria, …

Composition gazeuse • Moisisures aérobies • Aérobies « tolérantes » • Rôle limitant et sélectif du rapport O 2 / CO 2 • Aptitude au confinement : Penicillium roqueforti • Anaérobies rares : Byssochlamys nivea

Influence du substrat • Rupture des défenses naturelles (graines, fruits, etc. ) • Résistance mécanique au tassement (volume d’air intergranulaire en stockage) • Sélection naturelle des espèces cellulolytiques : Stachybotrys sur pailles • Spécificité d’hôte : Penicillium expansum sur pommes • A contrario : Penicillum roqueforti sur gélose !

Conditions biologiques de développement • Intensité de la sporulation • Longévité des spores • Compétitivité entre espèces biologiques : • Fongiques : Trichoderma viridae est presque exclusif • Bactériennes : vitesse de croissance, p. H, aw

Mycotoxicogénèse Grande diversité de familles chimiques (conséquence du métabolisme secondaire) • Dérivés des acides aminés • • Voie des polyacétates • • Alcaloïdes de l’ergot de seigle, acide aspergillique, gliotoxine, roquefortine, sporidesmines Aflatoxines, acide pénicillinique, citrinine, fumonisines, ochratoxines, patuline, stérigmacystine, zéaralénone Dérivés des terpènes • Diacétoxyscirpénol, déoxynivalénol, trichothécènes, verrucarines

Moisissure ? mycotoxine • La présence – à un moment donné – d’une moisissure toxinogène est nécessaire pour qu’il y ait éventuellement production de mycotoxine • La présence d’une moisissure – même toxinogène – n’implique pas obligatoirement la présence de mycotoxine • L’absence de moisissure n’implique pas obligatoirement l’absence de mycotoxine

Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes Denrées Espèces toxiques contaminantes Blé, farine, - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor pain, maïs, - Penicillium citrinum, P. citreoviride, P. chips cyclopium, P. martensii, P. patulum, P. pubertum - Fusarium moniliforme Arachide, noix - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. expansum Mycotoxines probables Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Patuline Désoxynivalénol (DON) Zéaralénone Fumonisine Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Trichothécènes Cytochalasines Patuline Acide cyclopiazonique

Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes Denrées Espèces toxiques contaminantes Mycotoxines probables Tourte à la - Aspergillus flavus viande, viande cuite, fromage, - Penicillium viridicatum, P. roqueforti, P. patulum, P. commune cacao, houblon Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Patuline Viandes, porc - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. salé, fromage versicolor Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Patuline, Pénitrem A - Penicillium viridicatum, P. cyclopium Poivre noir et rouge, pâtes - Aspergillus flavus, A. ochraceus Aflatoxines, Ochratoxine A

Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes Denrées Espèces toxiques contaminantes Fèves, - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor orge, maïs, sorgho, soja - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. viridicatum, P. expansum, P. islandicum, P. urticae - Fusarium moniliforme - Alternaria Pâtisserie - Aspergillus flavus, A. versicolor réfrigérée ou congelée - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. viridicatum, P. martensii, P. citreoviride, P. urticae, P. palitans, puberulum, P. roqueforti Mycotoxines probables Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Citrinine Patuline Griséofulvine Alternariol Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Citrinine, Pénitrem A

Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes Denrées Espèces toxiques contaminantes Denrée - Aspergillus alimentaire - Penicillium (stockage domestique) - Fusarium oxysporum Pomme et produits dérivés de pomme - Penicillium expansum Mycotoxines probables Aflatoxine, Ochratoxine A Acide kojique Patuline, Pénitrem A Acide pénicillique Trichothécènes Patuline

Moisissures et mycotoxines retrouvées dans divers aliments Champignon Aspergillus Fusarium Toxines Denrées Aflatoxines, stérigmatocystine, ochratoxine Maïs, arachides, graines de coton, A graines de potiron, riz, haricot, tissus d’animaux (jambon, lard, saucisses, lait et dérivés Trichothécènes (désoxynivalénol = DON, nivalénol = NIV, toxine T 2, diacétoxyscirpénol = DAS), zéaralénone, fumonisine, fusarine, moniliformine Blé, maïs, orge, riz, seigle, avoine, noix Penicillium Patuline, citrinine, pénitrem A, acide cyclopiazonique, ochratoxine A Fruits et jus de fruits, blé, riz, fromage, noix Alternaria Alternariol, acide ténuazonique Fruits, légumes et produits dérivés de pommes et tomates Claviceps Alcaloïdes de l’ergot Blés et dérivés, seigle

Moisissures présentes dans les fourrages et produits en silo Espèce fongique Mycotoxine Aspergillus flavus, A. parasiticus Aspergillus ochraceus Aspergillus fumigatus Aflatoxines, acide cyclopiazonique Ochratoxine A Fumigaclavines, gliotoxine Stérigmatocystine Ochratoxine A, citrinine, acide cyclopiazonique Verrucosidine, viomelléine, xanthomégnine Fumiclavine, roquefortine, PR toxine Fusarium culmorum, F. graminearum, F. sporotrichoides Désoxynivalénol (DON), toxine T 2, diacétoxyscirpénol (DAS), zéaralénone Fumonisine, moniliformine Aspergillus versicolor Penicillium veridicatum, P. cyclopium Penicillium aurantogriseum Penicillium roqueforti Pithomyces chartarum Wallamia sebi Stachybotris atra Sporodesmine Walleminol A Satratoxines Fusarium moniliforme Claviceps Ergotamine, ergostine, ergocrystine, acide lysergique Alternaria Acide ténuazonique, alternariol Acremonium lolii Acremonium coenophialum Phomopsis leptostromiformis Lolitrem, paxilline Ergopeptine Phomopsines

Expression des mycotoxicoses Cutanée Nerveuse Vasculosanguine Génitale Hépato-biliaire et rénale Ergotisme Clavatoxicose Aleucie toxique alimentaire Zéaralénone toxicose Aflatoxicose Eczéma facial des Diplodia-toxicose ruminants Dermatose des manipulateurs de céleri (Gangrène sèche de la fétuque) (Hyperkératose des bovins) Sialorrhée des ruminants Fusariotoxicose Stachybotriotoxicose Leuco. Maladie du mélilot encéphalomalacie âgé des équidés (Maladie des tremblements) Phytooestrogènes : coumestrol Eczéma facial des ruminants Ochratoxicose (± citrinine) (Néphropathie endémique des Balkans) Phomopsistoxicose (lupinose)

Formes aiguës de mycotoxicoses chez les animaux domestiques Mycotoxicose Espèces fongiques Mycotoxines Espèces animales Syndrome primaire Fusariose Fusarium moniliforme Fumonisine B 1 Porc Œdème pulmonaire Vomitoxicose Fusarium sporotrichoides Désoxynivalénol Porc Entérite, vomissements T 2 toxicose Fusarium Toxine T 2 Porc, veau, volailles Nécrose dermique, gastroentérite DAS toxicose Fusarium Diacétoxyscirpénol Porc Nécrose du tube digestif, hémorragies Leucoencéphalom alacie Fusarium moniliforme Fumonisine B 1 Cheveau Incoordination des mouvements F 2 toxicose Fusarium graminearum Zéaralénone Porc Oestrogénisme

Formes aiguës de mycotoxicoses chez les animaux domestiques Mycotoxicose Espèces fongiques Mycotoxines Espèces animales Syndrome primaire Aflatoxicose Aspergillus spp. Aflatoxines Volailles, veau, porc, chien Hépatite, hémorragies, mort Ergotisme Claviceps Acide lysergique Veau, mouton, poulet Gangrène, crise nerveuse, baisse de la reproduction Eczéma facial Phitomyces Chartarum Sporidesmines Mouton, veau Photosensibilisation, cholangiome Ochratoxicose Aspergillus ochraceus Penicillium viridicatum Ochratoxine A Porc, dindons, volailles Néphropathie Stachybotryotoxicose Stachybotrys atra Satratoxine, verrucarine Chevaux Nécrose dermique, gastroentérite, dépression du système hématopoïétique Trémor Acremonium spp. Pénitrem A Veau, mouton, chien Ataxie, prostration Slaframine Veau, mouton Salivation, diarrhée, polyurie Slaframine toxicose

Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Maladie (aiguë) Symptômes Espèces fongiques Ergotisme gangréneux Vasoconstriction, Claviceps Mycotoxines Substrats Pays Alcaloïdes de l’ergot Seigle, céréales Ethiopie, Inde Fusarium spp. Trichothécènes Céréales, pain Russie, Japon, Corée Maladie de Kaschim-Beck Arthrite osseuse Fusarium spp. Trichothécènes Céréales Chine Onyalai Hémorragie du Phoma sorghina Acide rhino-pharynx et ténuazonique tube digestif Millet Afrique du Sud Béribéri cardiaque Anomalie cardiaque, mort par dépression respiratoire Riz Japon gangrène Aleucie toxique Brûlures alimentaire digestives, (ATA) nausées, vomissements purpurea, C. fusiformis Penicillium Citréoviridine

Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Espèces fongiques Mycotoxines Maladie (aiguë) Symptômes Kwashiorkor Dénutrition énergétique Aspergillus parasiticus Aflatoxines Céréales Kenya, Soudan (enfant) Syndrome de Reye Accumulation Aspergillus d’acides gras : parasiticus foie, rein, cœur, encéphalopathie, œdème Aflatoxines Céréales Thaïlande (enfant) Kodua Somnolence, perte d’équilibre, troubles nerveux Acide cyclopiazonique Millet Inde Hépatite aiguë Jaunisse, œdème Aspergillus flavus, Aflatoxines Aspergillus parasiticus Céréales (maïs) Inde, Afrique Dermatite Allergie cutanée Céleri Aspergillus flavus Sclerotinia Psoralène Substrats Pays

Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Maladie (chronique) Symptômes Cancer de l’œsophage Tumeurs Cirrhose (enfant) Espèces fongiques Fusarium spp. Mycotoxines Fumonisine, fusarine C Substrats Pays Céréales Afrique du Sud Nécrose du foie Aspergillus spp. Aflatoxine Céréales Inde Hépatocarcinomes Tumeur du foie Aspergillus spp. Aflatoxine Céréales Afrique, Inde Néphropathie endémique Nécroses des tubules et glomérules Penicillium verrucosum Aspergillus ochraceus Céréales Ex-Yougoslavie, Bulgarie Ochratoxine A

Aflatoxines

Mycologie • Aspergillus flavus • Aspergillus parasiticus • Penicillium verrucosum Aspergillus flavus Penicillium verrucosum Aspergillus parasiticus

Substrats • Nombreux produits agricole (arachides, céréales, tourteaux d’arachides, cacahuètes, …) • Incidence importante dans la nourriture animale et humaine en régions tropicales

Conditions de croissance des souches toxinogènes • Températures : • Minimale : 12 °C • Maximale : 42 °C • Optimale : 28 – 30 °C • Humidité relative en eau : 80 % • Infection au champ, mais surtout au stockage

Toxinogénèse • La croissance des champignons toxinogènes et la production d’aflatoxines sont influencées par différents facteurs : • Le type de substrat • La teneur en humidité • La température • Les dommages éventuels du substrat • L’humidité relative de l’environnement

Structures et propriétés physicochimiques • 1963 : Asao propose la structure chimique des aflatoxines : ce sont des flavocoumarines • Stables à la chaleur (250 °C), au froid, à la lyophilisation • Instables à la lumière et aux UV • Hydrolysables en milieu alcalin • Solubles dans les solvants peu polaires (méthanol)

Biosynthèse • 1992 : Chang découvre le gène responsable de la biosynthèse des aflatoxines • Le cluster (zone regroupant les gènes) des aflatoxines est situé sur un fragment de 7, 5 kb d’un chromosome de 4, 9 Mb • La biosynthèse des aflatoxines est composée de 4 grandes étapes générant des intermédiaires issus de diverses réactions chimiques et enzymatiques sous le contrôle du cluster afl. R

Métabolisme

Absorption • Voie orale • Leur lipophilie gouverne leur absorption par un phénomène de diffusion passive • Maximale à un p. H 5 et au niveau du jéjunum • Voie respiratoire

Distribution • Liaisons non covalentes avec l’albumine et l’hémoglobine • Phénomène de diffusion pour pénétrer dans le cytoplasme • Stockage dans l’organisme par liaisons covalentes avec molécules tissulaires • Passage trans-placentaire

Métabolisation • Pour être toxique ou mutagène, l’aflatoxine doit être métabolisée • La métabolisation est principalement réalisée par l’intervention des cytochromes hépatiques : • Epoxydation par l’intervention de cytochromes P 450 hépatique et pulmonaire • • • Hydroxylation • Réduction en aflatoxicol par la NADPH réductase O-déméthylation Epoxyde hydrolase ou glutathion-Stransférase

Elimination • Par voie biliaire • • Surtout des métabolites conjugués Parfois aflatoxine B 1 sous forme libre Par voie urinaire • • • Représente 60 % de l’élimination totale Présence d’autres métabolites Servent de marqueurs dans les intoxications Par voie lactée • • • Uniquement aflatoxine M 1 Problèmes pour l’allaitement Problèmes pour les denrées à base de lait

Biotoxicologie

Action sur les synthèses cellulaires Action sur l’ADN • L’aflatoxine B 1 ou son époxyde peut s’intercaler au sein de l’ADN • L’aflatoxine B 1 se fixe plus fortement dans les zones transcrites • Cette fixation dépend de la séquence nucléotidique et de la taille du fragment • Le site préférentiel est au niveau de la guanine dans les séquences contenant des cytosines

Action sur les synthèses cellulaires Action sur l’ARN • L’aflatoxine B 1 a une grande affinité pour l’ARN nucléaire et cytoplasmique et elle en affecte le métabolisme par inhibition de l’activité de l’ARNpolymérase • L’effet varie en fonction de la dose d’aflatoxine B 1

Action sur les protéines • La synthèse des protéines intra- et extracellulaires est réduite

Action sur les métabolismes Métabolisme des glucides • Réduction du glycogène hépatique • Interférence avec le métabolisme énergétique des cellules animales • Inhibition de la consommation d’oxygène des tissus

Action sur les métabolismes Métabolisme des lipides • Accumulation de lipides dans le foie • Diminution des concentrations sériques du cholestérol, des triglycérides, des phospholipides • Perturbation de la synthèse et le transport des lipides • Perturbation de l’absorption et la dégradation des lipides

Immunotoxicité • Effets immunosuppresseurs après ingestion (et inhalation) • Prédisposition à une surinfection par diminution des défenses immunitaires

Tératogénicité • Malformations fœtales

Prévention

Prévention : lutte contre la contamination Avant la récolte • Utilisation de souches aspergillaires non aflatoxicogènes : • Agent biocompétitif • En plein essor • Uniquement dans les pays industrialisés car coûteuse

Prévention : lutte contre la contamination • Autres moyens • Élimination des pieds desséchés • Irrigation suffisante • Sélection de variétés de culture

Prévention : lutte contre la contamination Lors de la récolte • Le ramassage • A maturation • Manuel ou mécanique • Le nettoyage et la séparation • Début du traitement industriel (taux résiduel d’aflatoxines possible)

Prévention : lutte contre la contamination • Le séchage • Teneur en humidité < 9 % • Souvent à l’air libre en Afrique • Le stockage • Dans des silos le plus souvent • Atmosphère contrôlée (température, humidité, CO 2, …)

Prévention : lutte contre la contamination Le triage • Manuel • Dans les pays sous développés • Analyses macroscopiques et morphologiques • Mécanique • Sélection par pression – dépression • Procédés Sortex, Zig-Zag, Wogan

Prévention : détoxification Les traitements physiques • Inactivation thermique • • • Diminution de la qualité et de la quantité des protéines Irradiation • • Inactivation totale à partir de 267 °C Rayon gamma, UV, micro-ondes Adsorption par les solvants • Utilisation de boue, de charbon activé, …

Prévention : détoxification Les traitements chimiques • Moins coûteux que les autres techniques • Applicables sur les aliments, les concentrés, … • Existence de deux sites d’ouverture entraînant l’inactivation de l’aflatoxine B 1

Prévention : détoxification Les traitements chimiques • • • Ammoniation : méthode de référence Bisulfites Chlore : effets mutagènes Ozone : peu d’information Hypochlorite de sodium : grande efficacité Peroxyde d’hydrogène (uniquement en milieu liquide basique) : modification de la qualité protéique (et donc de la valeur nutritive)

Prévention : détoxification La décontamination biologique • Bioconversion : Mucor griseocyanus

Ochratoxine A

Mycologie • Genre Aspergillus • Aspergillus ochraceus • Aspergillus niger • Aspergillus carbonarius

Mycologie • Aspergillus ochraceus • Croissance : température optimale de 24 à 37 °C ; p. H de 3 à 10 • Sur milieux de Czapek : colonies granuleuses de couleur ocre, revers brun jaunâtre

Mycologie • Genre Penicillium • Penicillium verrucosum ou Penicillium viridicatum • Principal producteur d’ochratoxine A en climats tempérés (20 °C) • Thalle velouté vert - bleu à vert - gris et revers orangebrun sur milieu CYA

Patuline

Mycologie • La patuline est produites par des divers champignons appartenant aux genres : • Penicillium : P. expansum, P. patulum, P. claviforme, … • Aspergillus : A. clavatus, A. gigantus, A. terreus • Paecilomyces variotii • Byssochlamys : B. nivea, B. fulva

Penicillium expansum • • Principal responsable des contaminations • Champignon bi ou triverticillé, avec un conidiophore lisse, des métules et des phialides rassemblées en verticilles et des conidies elliptiques Colonie verte terne, avec un mycélium blanc en marge et un exsudat orange brun caractéristique

Conclusion • Connaissances scientifiques très insuffisantes : requièrent la collaboration de mycologues, médecins, pharmaciens, vétérinaires et toxicologues

Conclusion • Principaux axes de recherche : • Ecologie des champignons et conditions de sécrétion • Moyens préventifs de lutte • Méthodes chimiques et biologiques de détection rapide • Détoxification sans dénaturation • Recherche des mycotoxines comme causes possibles de maladies humaines mal connues