Chamonix 25 janvier 2019 Thrapie gnique de lhmophilie

Chamonix, 25 janvier 2019 Thérapie génique de l’hémophilie Sandra Le Quellec, MD, Ph. D Lyon

PRISE EN CHARGE DIAGNOSTIQUE Hémophilies Facteur déficitaire Gène atteint Transmission génétique Incidence Hémophilie A Hémophilie B Facteur VIII Facteur IX F 8 : Xq 27 F 9 : Xq 28 transmission récessive liée à l’X Mutation de novo dans ~ 30% des cas 1/5000 garçons 1/25000 garçons 2

INTRODUCTION Hémophilies � Phénotype hémorragique corrélé à la sévérité du déficit: HA/HB Sévère HA/HB modérée FVIII: C/FIX: C<1 IU/dl FVIII: C/FIX: C=1 -<5 IU/dl Saignements spontanés Saignements HA/HB mineure provoqués FVIII/C/FIX: C=5 -<40 IU/dl � Saignements spontanés: articulation (+++), muscle (++), cerveau, etc… Saignements répétés 3

Hémophilie Types de thérapie génique Thérapie génique in vivo Thérapie génique ex vivo

Hémophilie Thérapie génique et hémophilie? Thérapie génique in vivo � � � Hémophilies : maladies monogéniques Amélioration du phénotype hémorragique à de faibles taux de FVIII: C/FIX: C >1% Modèles animaux caractérisés (souris, chien, etc… HA/HB)

Hémophilie Thérapie génique et hémophilie Thérapie génique in vivo ADNc F 8 domaine B-délété/F 9 Vecteur : virus adéno-associé (AAV) � � « non intégratif » épisomal Non réplicatif: requiert un virus helper pour se répliquer (i. e adenovirus) Non pathogène chez l’Homme Transduction des cellules en division ou quiescentes Organe cible: foie

Différents types d’AAV Séroprévalence : 44 -59% 19 -55% 37% 3, 2 -26% Boutin et al. , Human Gene Ther 2010 ; Stanford et al. , Haemophilia 2016 Li et al. , Gene Ther 2012 ; Mingozzi F, Blood 2013

Vecteur AAV recombinant Virus non-enveloppé 25 nm ADN simple chaine ~4, 7 kb Signal de packaging Vecteurs AAV recombinant h. FVIII-BDD/h. FIX c. DNA Adapted from Mingozzi F, Blood 2013

Production d’un vecteur r. AAV Triple co-transfection de cellules HEK 293 T = HEK 293

Production d’un vecteur r. AAV HEK 293 T Baculovirus Cellules transfectées Origine humaine Sf 9 = cellules d’insecte Milieu de culture Avec et sans sérum Sans sérum Efficacité de production ~1 x 105 r. AAV/cellule Particules 1 -30% des r. AAV contiennent le GOI 7 -30% des r. AAV contiennent le GOI ADN contaminants ≤ 6% vecteur plasmidique ≤ 0, 1% rep-cap ≤ 0, 5% génome humain ≤ 3% r. Bac ≤ 0, 1% rep-cap ≤ 0, 05% génome insecte Protéines contaminantes Protéines cellulaires Protéines d’adénovirus 5 Protéines cellulaires Protéines de baculovirus ~2 x 105 r. AAV/cellule Urabe M et al. , Hum Gen Ther 2002 Galibert L et al, J Intervertebr Pathol 2011

Procédés de purification des r. AAV � Divers procédés de purification : Gradients de densité Chlorure de césium Chromatographies Iodixanol Échangeuse d’ions D’affinité

Titration des r. AAV � Différentes techniques de titration des vecteurs ◦ q. PCR ◦ Southern/Dot Blot ◦ Gel d’agarose alcalin ◦ ELISA anti-AAV Mesure du « vector genome » = quantité particules r. AAV pleines Mesure antigénique de capside virale = quantité de particules r. AAV totales (pleines+vides)

Transduction in vivo 1 h pour la vie? Adapted from Ding et al. , Gene Ther 2005

Faible dose: 2 x 1011 vg/kg • FIX: C = 1, 8 ± 0, 7 IU/dl Dose moyenne: 6 x 1011 vg/kg • FIX: C = 2, 5 ± 0, 9 IU/dl Forte dose: 2 x 1012 vg/kg • FIX: C = 5, 1 ± 1, 7 IU/dl • ↑ transitoire des transaminases, résolutive sous corticoïdes Nathwani A et al. , NEJM 2011

+ 4 patients cohorte 2 x 1012 vg/kg Saignements Concentrés de FIX 96% 94% Nathwani A et al. , NEJM 2014

Spk-9001 (=fidanacogene elaparvovec) Dose: 5 x 1011 vg/kg N=15 FIX: C = 33, 7± 18, 5 IU/dl Saignements 98% Concentrés de FIX 99% George L et al, NEJM 2017 With courtesy of Sparks Therapeutics

AMT-060 Cohorte 1, dose 5 x 1012 vg/kg FIX: C = 4, 4 (1, 5 -7, 3) IU/dl Saignements 53% Concentrés de FIX 81% Cohorte 2, dose 2 x 1013 vg/kg FIX: C = 6, 9 (2, 6 -11, 3) IU/dl Saignements Concentrés de FIX 70% 73% Miesbach W et al. , Blood 2018

Résumé des essais cliniques de thérapie génique pour l’hémophilie B Clinicaltrial Compagnie Nom NCT 00979238 UCL/St Jude - NCT 02484092 Sparks Therapeutics NCT 02396342 Vecteur-promoteur -transgène Dose (vg/kg) FIX: C (IU/dl) Suivi sc. AAV 2/8 -LP 1 -h. FIXco 2 x 1011 6 x 1011 2 x 1012 1, 4 -7, 2 >8 ans Spk 9001 ss. AAV~8(Spk 100)-h. AAT-h. FIXco. R 338 L 5 x 1011 14 -81 >2 ans uni. Qure AMT-60 sc. AAV 5 -LP 1 -h. FIXco 5 x 1012 2 x 1013 1, 3 -6, 8 3, 1 -12, 7 >2, 5 ans NCT 03569891 uni. Qure AMT-61 sc. AAV 5 -LP 1 -h. FIXco. R 338 L 2 x 1013 31 >6 sem NCT 03369444 Freeline Therapeutics FLT 180 a sc. AAV~8(FLT 180 a)-LP 1 -h. FIXco 4, 5 x 1011 >40 >14 sem NCT 01687608 Shire BAX-335 sc. AAV 8 -LP 1 -h. FIXco R 338 L 2 x 1011 1 x 1012 3 x 1012 NCT 02618915 Dimension Therapeutics DTX-101 ss. AAVrh 10 -h. FIXco 1, 6 x 1012 NCT 02695160 Sangamo SB-FIX AAV 2/6 -ZFN 1 + +AAV 2/6 -F 9 - 20 -25 (n=1/7) <2 > 1 an >1 an - -

Résumé des effets indésirables pour l’hémophilie B � Aucun développement d’anticorps anti-FIX � Aucun effet indésirable grave � 29% (16/55)Élévation des transaminases hépatiques ◦ ◦ Asymptomatique Entre 4 et 10 semaines après injection d’AAV Résolutive sous traitement par corticoïdes +/- associée à une baisse des taux de FIX

BMN 270 (=Valoctocogene Roxaparvovec) 6 x 1013 vg/kg (n=7) FVIII: C=93 ± 48 IU/dl (dosage coagulométrique) 4 x 1013 vg/kg (n=6) FVIII: C=45 (41 -55) IU/dl (dosage coagulométrique) Saignements Concentrés de FVIII 97% 94% Rangarajan S et al, NEJM 2017

République hémophilie Spk 8011 Capside : LKO 3 (Spk 200) ADN : single-stranded Promoteur : h. AAT Transgène: BDD h. FVIIIco-SQ Saignements Concentrés de FVIII 82% � 98% Depuis : ◦ +1 patient dans la cohorte 1 x 1012 vg/kg ◦ +7 patients dans la nouvelle cohorte 2 x 1012 vg/kg FVIII: C=30 IU/dl (<5 -49) With courtesy of Sparks Therapeutics

Résumé des essais cliniques de thérapie génique pour l’hémophilie A NCT Compagnie Nom Vecteur-transgène Doses (vg/kg) FVIII: C (IU/dl) Suivi NCT 02576795 Bio. Marin BMN 270 ss. AAV 5 -HLP-BDD h. FVIIIco-SQ 6 x 1013 4 x 1013 12 -273 2 -45 78 sem 24 sem NCT 03003533 Spark Therapeutics Spk 8011 AAV(Spk 200) -BDD h. FVIII 5 x 1011 1 x 1012 2 x 1012 <5 -49 66 sem NCT 03001830 UCL/St Jude Go-8 ss. AAV 2/8 -HLP-h. FVIIIco-V 3 2 x 1011 6 x 1011 2 x 1012 >5% >14 sem NCT 03370172 Shire BAX-888 ss. AAV 2/8 -TTR-BDD h. FVIIIco-SQ 2 x 1012* 8 x 1012* - - NCT 03061201 Sangamo Therapeutics SB-525 ss. AAV 2/6 -BDD h. FVIIIco-SQ - - - Pour l’essai BAX-888 : unité « capsid particles/kg » (titration par ELISA anti-AAV)

Résumé des effets indésirables poru l’hémophilie A � � � Aucun développement d’anticorps anti-FVIII 1 EIG en rapport avec BMN 270 : fièvre, myalgie, céphalée dans les 24 h post-injection 4 x 1013 vg/kg 43% (16/37) élévation des transaminases hépatiques ◦ ◦ Asymptomatique Entre 4 et 10 semaines après injection d’AAV Résolutive sous traitement par corticoïdes Non associée à une baisse des taux de FVIII

Challenges de la thérapie génique de l’hémophilie Efficacité à long terme de manière constante Réadministration de vecteurs? Sécurité à long terme des fortes doses d’AAV?

Réadministration? � AAV « non intégratif » (épisomal+++) et leur transduction dans la cellule hôte est limitée par la présence d’Ac neutralisants (NAbs) � Durées maximum d’efficacité rapportées: ◦ Chez les hommes hémophiles B sévères: > 8 ans ◦ Chez les animaux (chiens, primates) : > 10 ans Nathwani AC et al, NEJM 2014; Reiss UM and colleagues. NHF 14 th Workshop on Gene Therapy and Novel Technologies for Hemophilia; February 23 -24, 2018; Washington, DC. ; Bortolussi G, et al. Hum Gene Ther. 2014

Etudes pré cliniques en période néonatale Souris Puberté ~ 42 j Age (jours) ***, p<0. 001; ns, not significant Bortolussi et al. , Human Gene Ther 2014

Poids du foie en fonction de l’âge SOURIS HUMAINS Puberté ~ 42 jours Liver Weight (g) Puberté ~ 12 ans 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Taille adulte >x 2 0 Age (jours) Bortolussi et al. , Human Gene Ther 2014 10 Age (ans) 20 With courtesy of F. Mingozzi, Sparks Therapeutics Coppoletta, Am J Pathol, 1932; Garby, Am J Hum Biol, 1993

Stratégies pour réadministrer des vecteurs AAV • Pseudotyping • Rapamycine? • Capsides mutées Changer le sérotype de l’AAV Modifications des capsides Modulation de la réponse immune Méthodes physiques • Plasmaphérèse • Protection contre les NAbs (exosome -AAV) Adapted from Masat et al. , Disc Med 2013

Pseudotyping � � � N=66 patients hémophiles de pédiatrie, médiane de suivi 48 mois, ~ 4, 5 prélèvements par patients (n=277 échantillons) Li C et al, Gene Ther 2012

Moduler la réponse immune : rationel l’humain, les Ac spécifiques anti-capside persistent, à haut titre, longtemps (> 8 ans) après une seule injection de vecteur AAV Titre Anti-AAV neutrlalisants (1/x) � Chez 4000 10 ans 3000 2000 1000 0 0 1 21 73 14 4 28 35 5 6 jours 49 7 8 Administration de vecteur AAV Nathwani AC et al, ASH 2018

Moduler la réponse immune: co-administration de rapamycine SVP[Rapa]: Nanoparticules synthétiques, biodégradables contenant de la rapamycine PRIME BOOST AAV 8 -Luciferase +/- SVP[Rapa] AAV 8 -FIX +/- SVP[Rapa] Contrôle: nanoparticules vides Time Endpoints: • Antibodies to AAV 8 • FIX transgene expression in plasma • Vector genome copy number (Luc and FIX) • B and T cells responses Mingozzi F et al, Blood 2007 Clinicaltrials. gov ID# NCT 02648269

Moduler la réponse immune: co-administration de rapamycine � � N=5 souris par groupe Dose : 4 x 1012 vg/kg SVP[Rapa] NP (SVP[vide]) +/-SVP[Rapa] � Résultats similaires chez le primate (non humain) Meliani et al. , Nature Comm 2018

Moduler la réponse immune: co-administration de rapamycine � N=3 primates non humains h. FIX (ng/ml) J 45 post réadministration de vecteur AAV-FIX 900. 00 800. 00 700. 00 600. 00 500. 00 400. 00 300. 00 200. 00 100. 00 SVP[Rapa] SVP[vide] t. NP � t. NP NP réadministration possible chez le primate (non humain) ! With courtesy of F Mingozzi, Sparks Therepeutics Meliani et al. , Nature Comm 2018

Conclusions � Sécurité et efficacité de la thérapie génique ◦ Réduction des saignements ◦ Réduction de la consommation en facteurs ◦ Espoir de guérison? � Panel de choix en augmentation: ◦ Diversité des vecteurs r. AAV ◦ Variabilité des résultats d’une étude à l’autre : quelle prédictibilité? � Challenges: ◦ Gestion de la réponse immune et de l’élévation des enzymes hépatiques ◦ Déterminer la sécurité et l’efficacité sur le long terme �Réinjection possible? Avec quel AAV? Pédiatrie?

Remerciements Organisation du SHIP 2019 Pr H. Chambost Dr F. Mingozzi Merci pour votre attention