Centro de Biologia Molecular Estrutural Universidade Federal de

Centro de Biologia Molecular Estrutural Universidade Federal de Santa Catarina Departamento em Bioquímica Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Projeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação “Como a Bioquímica auxilia na descoberta de novas terapias” Palestrantes: • Gabrielle do Amaral e Silva Muller: “Como a proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos terapêuticos” • Priscila Graziela Alves Martins: “Inibição enzimática como novo alvo para o tratamento de doenças como tuberculose, diabetes e peste” • Tiago Bortolotto: “Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) podem ser usados em terapias? ”

Centro de Biologia Molecular Estrutural Universidade Federal de Santa Catarina Departamento em Bioquímica Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Projeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação Como a proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos terapêuticos Gabrielle do Amaral e Silva Muller 201007739 Florianópolis, 02 de junho de 2011

Proteoma • A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um gen. OMA. • Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo. • Técnica que visa caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares. DNA Pré- RNAm Proteoma

Por que utilizar a proteômica Moléculas biomarcadoras são utilizadas como uma importante ferramenta para detecção e monitoramento e tratamento de doenças. O status patológico de um indivíduo pode ser verificado por : Genes alvos: presente em células sadias e patogênicas. Alterações na transcrição: RNA muitas vezes é expresso, porém não é traduzido. Proteínas: refletem diretamente se o individuo está com determinada doença por meio da interação ptn-anticorpo – ELISA. Na busca de novos alvos terapêuticos vem sido utilizada a proteômica, pois ela revela proteínas biomarcadoras permitindo a identificação de indivíduos doentes X indivíduos saudáveis.

Proteômica • Em 2004, haviam 1619 artigos somente com pesquisas na área da proteômica (hoje - 29564); • Destes 192 artigos eram referente a proteômica clínica (hoje - 3702); • E, 71 eram referentes a procura de moléculas biomarcadoras utilizando-se a proteômica como ferramenta (hoje - 5247);

Câncer • Diagnóstico: Próstata, mama, pâncreas, fígado, câncer de cabeça e nuca; • Proteínas sinalizadoras são pouco abundantes em estágios iniciais; • Falso negativo: indivíduos com câncer o exame negativo; • Falso positivo: indivíduos sem câncer e exame positivo; Proteína CA – 125 (Câncer ovariano): são positivos 50 % a 60%. É elevado endometriose e gravidez;

National Cancer Institute • 2006: Clinical Proteomic Technologies for Cancer (CPTC) foi fundada para acelerar o desenvolvimento de tecnologias mais sofisticadas na busca de biomarcadores.

Proteômica

Vantagens proteômica • Técnica relativamente barata; • Rápida; • Poderosa ferramenta na busca por biomarcadores em fuidos e tecidos humanos; • Géis 2 DE com espectrometria de massa e a utilização de sofisticadas ferramentas de bioinfomática são capazes de discriminar estados iniciais da doenças, de tumores belignos e malignos.

Desvantagens proteômica • Grande quantidade de proteína; • Não detecta proteínas pouco abundantes; • Durante a detecção pode ir outros tecidos e isso pode resultar na diminuição da precisão do método; • Antes de iniciar a busca por biomarcadores é necessário a padronização e reprodutibilidade dos géis; • Comprovação em diversos laboratórios;

Proteômica protéico de: sistemática: üTecidos üCélulas üCompartimentos celulares mapa Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência: üDesenvolvimento üInterações entre microorganismos e hospedeiros üTratamentos

Fluxograma das etapas experimentais

Extração da amostra 1. Não existe um método Universal; 2. Objetivo a serem visualizados no gel 2 DE: Maior quantidade de proteína possível ou somente um subgrupo de proteínas; Tampão de lise Solubilização das ptns Lise mecânica da célula Métodos de ruptura celular Gelo por 20 min 30´ a 1200 x g Diversas macromoléculas Proteínas

Métodos de quantificações de proteínas 2 D Quant Kit Com base na concentração da curva padrão da BSA. Proteínas oriundas da extração 480 nm Bradford Com base na concentração da curva padrão da BSA. 545 nm

Limpeza das amostras • Fosfolipídios e ácido nucléicos: listras horizontais; • Sal provoca alta condutividade na fita de p. H: pode provocar desidratação em algumas porções do gel e hidratação em outras. • Ácidos nucléicos: causam aumento da viscosidade da amostra, aparecimento de bandas adicionais, obstrui poros e liga-se a proteínas. • Polissacarídeos: bloqueiam poros do gel, aumenta o tempo de focalização; • Lipídeos: ligam-se a proteínas e diminuem a mobilização das mesmas no gel.

Solubilização das proteínas Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia Agentes Surfactantes: CHAPS Agentes redutores: DTT

Re-Hidratação da amostra em gradiente de p. H • Temperatura ambiente 25 o. C; • Over night; Tiras de strip com p. H imobilizado Tampões-acrilamida Gradiente Faixa de p. H Linear 4, 0 -7, 0 6, 0 - 11, 0 3, 0 - 10, 0 Não linear 3, 0 -10, 0

Separação das proteínas em 1ª Dimensão • • É um método eletroforético que separa as proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos; Primeiro passo: escolha a faixa de p. H ideal para a sua amostra; Temperatura; 3500 V a qual é mantida por até mils volts/hora; Corrente elétrica

Separação das proteínas em 1ª Dimensão Strips foram removidos Cerâmica IEF Strips foram posicionados Ajuste dos eletrodos Total: 15500 V/h e 25 u. A/strip Ettan IPGphor 3 Paper Pads umedecidos

Eletroforese em 2º Dimensão É um método eletroforético que separa componentes de uma amostra de acordo com o peso molecular. Esta técnica é realizada em gel de poliacrilamida contendo SDS. 12, 5% Preparação do gel em placas: 1. Homogêneo; 2. Concentração da acrilamida é graduada. Separação 2º dimensão Separação 1ª dimensão Após coloração com Coomassie Blue G-250 por 24 h

Análise das imagens dos géis üAnálise simultânea de diversas proteínas ü Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes.

Análise das imagens no gel Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa Presença ou Ausência de spots Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)

Digestão in-gel Série de passos Excisão dos spots Descoloração Desidratação tripsinização Extração dos peptídeos

Identificação das proteínas por espectrometria de massa q. Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos. q. Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas. q. Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações póstraducionais das proteínas. Sistema à vácuo Amostras 2 DE Fonte de ionização Analisador de massa Detector

Identificação das proteínas por espectrometria de massa 28

Obrigada!!