Centrifugana Organellu atdalana centrifgas gradient MSc biol Aija

Centrifugēšana Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā MSc. biol. Aija Ozola aija. ozola@biomed. lu. lv

Kas ir centrifugēšana? • Metode, ko izmanto, lai atdalītu pēc izmēra/ formas/blīvuma atšķirīgas vielas daļiņas, kas suspendētas šķidrumā centrifugēšana

Kas ir centrifugēšana? • Centrifugēšanu izmanto, lai nogulsnētu, atdalītu, izolētu: – Šūnas, baktērijas, vīrusus – Šūnu organellas – Makromolekulas (proteīnus, nukleīnskābes) • Centrifugēšanu lieto, kad materiālu nevar filtrēt, piemēram, ja tas satur daudz blīvu sastāvdaļu (šūnu, šūnu atlieku)

Centrifugēšanas fizikālie principi • Sedimentācija - daļiņas nosēšanās ārēja spēka ietekmē • Kādi ārējie spēki ietekmē daļiņu? – Zemes gravitācijas spēka lauks – Centrifugālā spēka lauks

Stoksa likums • Apraksta sfēriskas daļiņas gravitāciju, kur uz daļiņu iedarbojas 3 spēki: – Fg - gravitācijas spēks – Fb - peldspēja – Fd - šķidruma viskozitātes radīts spēks • Daļiņa sedimentēsies ar konstantu ātrumu, kad Fg = Fb + Fd

Stoksa likums d d šķ g d η v sfēriskās daļiņas diametrs daļiņas blīvums šķīduma blīvums daļiņai pieliktais paātrinājums (980 cm/s 2) sfēriskās daļiņas diametrs šķīduma viskozitāte sedimentācijas ātrums • Ātrums, ar kādu daļiņa sedimentēsies būs:

Stoksa likums • Secinājumi: – Sedimentācija ir proporcionāla: • daļiņas lielumam • daļiņas un šķīdumu blīvuma starpībai – Sedimentācija nenotiek, kad daļiņas blīvums ir vienāds ar šķīduma blīvumu – Sedimentācijas ātrums samazinās, palielinoties šķīduma viskozitātei – Sedimentācijas ātrums palielinās, palielinoties g

Centrifugēšana • Daļiņas sedimentācija centrifugālā spēka laukā ω Fc ω r centrifugālā spēka lauks rotācijas ātrums attālums no rotācijas ass r

Stoksa likums centrifugēšanā • Sedimentācijas ātrums: – gravitācijas ietekmē – centrifūgā

Relatīvais centrifugālais spēks (RCF) • Praksē pielieto: RCF ω r g relatīvais centrifugālais spēks rotācijas ātrums attālums no rotācijas ass gravitācijas paātrinājums 980 m/s 2 • Rāda, cik reizes lielāks spēks centrifūgas rotorā iedarbojas uz daļiņu, salīdzinot ar gravitācijas spēku (piemēram, 4000 x g)

Rotora griešanās ātrums • Praksē rotora griešanās ātrumu mēra apgriezienos minūtē – revolutions per minute (rpm) rotācijas ātrums ω rpm apgriezieni minūtē

RCF un rpm sakarība • Ja • un • tad RCF ω r rpm relatīvais centrifugālais spēks rotācijas ātrums attālums no rotācijas ass apgriezieni minūtē

RCF ↔ rpm: nomogrammas Zinot centrifūgas rotora rādiusu, RCF (g) iespējams pārvērst par rpm un otrādi http: //aquaticpath. umd. edu/nomogram. html

RCF ↔ rpm: online kalkulatori http: //insilico. ehu. es/mini_tools/rcf_rpm. php

Sedimentācijas koeficients • Raksturo daļiņas sedimentāciju centrifugējot S v ω r d • Atkarīgs no daļiņas: – lieluma – blīvuma – formas (kompaktuma) d šķ η sedimentācijas koeficients sedimentācijas ātrums rotācijas ātrums attālums no rotācijas ass daļiņas diametrs daļiņas blīvums šķīduma blīvums Šķīduma viskozitāte

Sedimentācijas konstante • Lai sedimentācijas koeficents būtu konstante, sedimentācijas koeficentu nosaka ūdenī 20°C • Bioloģiskām makromolekulām

Svedbergs (S) • Sedimentācijas konstantes mērvienība • Raksturo, ar kādu ātrumu daļiņa nogulsnēsies ultracentrifūgā • Theodor H. E. Svedberg (1884 – 1971) • 1926 (ķīmijā)

Sedimentācijas konstantes bioloģijā Eikariotu šūnas Šūnu kodoli Lizosomas Ribosomas (eikariotu) Ribosomas (prokariotu) Nukleīnskābes Proteīni 100 000 S 50 000 S 9400 S 80 S (60 S + 40 S) 70 S (50 S +30 S) 4 -100 S 2 -20 S

Sedimentācijas konstantes bioloģijā Koolman & Rohm. 2004. Color Atlas of Biochemistry.

Peldošais blīvums DNS peldošais blīvums Aprēķināts pēc ķīmiskā sastāva Koncentrētā Cs. Cl Ūdenī g/cm 3 2 1, 7 1, 1 Šūnu organellu peldošie blīvumi saharozes gradientā: Goldži komplekss 1, 06 – 1, 10 Plazmas membrāna 1, 16 Mitohondriji 1, 19 Lizosomas 1, 21 Ribosomas 1, 40 Šķīstošie proteīni 1, 30

Centrifugēšanas veidi 1. Diferenciālā centrifugēšana 2. Centrifugēšana blīvuma gradientā a) Zonālā b) Izopikniskā

1. Diferenciālā centrifugēšana • Metode, ar kuru vienkārši nogulsnēt šūnas un to sastāvdaļas, kas izdalītas no homogenāta • Pēc lieluma, blīvuma un/vai formas atšķirīgas daļiņas sedimentējas ar dažādu ātrumu • Problēmas: – kontaminācija (starp lielākām daļiņām atrodamas arī mazākas) – grūti atšķirt daļiņas ar līdzīgām īpašībām

Homogenizēšana • Process, kurā noārda audus, šūnu membrānas un atbrīvo šūnas saturu, iegūstot homogenātu • Empīriska metode homogenizators

Homogenizēšanas metodes • Fizikālas (lieto visbiežāk): – – – Berzes spēks Hidrodinamisko spēks Prese Ultraskaņa Sasaldēšana /atkausēšana Osmotiskais šoks • Ķīmiskās: – apstrāde ar enzīmiem homogenizators

1. Diferenciālā centrifugēšana

2. Centrifugēšana blīvuma gradientā a) Zonālā b) Izopikniskā • Gradients tiek pagatavots pirms centrifugēšanas • Gradients veidojas centrifugēšanas procesā • Gradienta koncentrācija ir neliela, rpm mazāk • Gradienta koncentrācija ir augsta, rpm vairāk • Paraugs tiek uznests gradienta • Paraugs tiek sajaukts ar augšpusē centrifugēšanas vidi • Balstās uz daļiņu lielumu un masu • Balstās uz daļiņu blīvumu

2. Centrifugēšana blīvuma gradientā a) Zonālā b) Izopikniskā • Gradientam jābūt pietiekami • Gradienta garumam nav tik garam, lai daļiņas atdalītos liela nozīme • Svarīgi nepārsniegt centrifugēšanas ilgumu • Centrifugēšanas laikam jābūt pietiekami garam, lai daļiņas nonāktu līdz to izopikniskajam punktam. Ilgāks centrifugēšanas laiks rezultātu neietekmē

2. Centrifugēšana blīvuma gradientā a) Zonālā Koolman & Rohm. 2004. Color Atlas of Biochemistry. b) Izopikniskā

Vides centrifugēšanai blīvuma gradientā Šūnas Vīrusi Šūnas organellas Nukleoproteīni Makromolekulas Cukuri (saharoze) + +++ + - Polisaharīdi (fikols) ++ ++ ++ - - +++ + +++ - - ++++ +++ + - ++ ++++ Gradients Koloidālais silīcija oksīds (perkols) Jodizētās vides (nikodenzs) Sārmu metālu sāļi (Cs. Cl) ++++ ļoti labs, +++ labs, ++ labs atsevišķos gadījumos, + ierobežota lietošana, - nepielieto

Centrifūgu tipi Laboratorijas Ātrgaitas Ultra- Maksimālais ātrums (rpm) 10 x 103 28 x 103 100/500 x 103 Maksimālais RCF 7 x 103 100 x 103 800/900 x 103 Baktērijas Jā Jā (Jā) Dzīvnieku un augu šūnas Jā Jā (Jā) Kodoli Jā Jā (Jā) Nogulsnēšana Dažreiz Galvenokārt (Jā) Membrānas Dažreiz Jā Ribosomas/polisomas - - Jā Makromolekulas - - Jā Vīrusi - Galvenokārt Jā Izmantošana izolēšanā ( ) – var izmantot, bet parasti nelieto

Ultracentrifūgas uzbūve

Rotoru tipi Leņķa Vertikālie Horizontālie Gallagher SR, Centrifugation, DOI: 10. 1002/9780470089941. et 0501 s 00

Rotoru pielietojums Centrifugēšanas veidi Rotora tips Leņķa Horizontālais Vertikālais Diferenciālā Teicams Zonālā Izopikniskā Ierobežota Labs makromolekulām, izmantošana slikts šūnām un šūnas organelām Labs šūnām un šūnas organelām, jāuzmanās lietojot Cs. Cl gradientu Neder Labs Teicams

Centrifūgas BMC • Beckman Coulter ultracentrifūga Optima L-100 XP • 100 000 rpm • Izmaksas ≈ 80 000 Ls (114 000 €) – centrifūga ≈ 40 000 Ls – 4 rotori ≈ 40 000 Ls

Noteikumi strādājot ar centrifūgu • Vienmēr jāsagaida, kad centrifūga sasniegusi maksimālo ātrumu un jāpārliecinās, ka tā normāli darbojas (nav aizdomīgu trokšņu vai vibrāciju) • Strādājot ar lieliem apgriezieniem – jāpārliecinās, ka izvēlēts pareizais rotors – jāizvēlas pareizie stobriņi • Centrifugēšanas stobriņiem jābūt līdzsvarā un tie jāizvieto simetriski!!!

Kā stobriņus pareizi izvietot? http: //onfocuslaboratories. com/support/content/balancing-your-centrifuge

Kā stobriņus pareizi izvietot? Eppendrof manual

Praktiskais darbs • Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā 1. Mononukleāro šūnu (limofocītu) izdalīšana no asinīm. NB!!! Ar asinīm strādāt cimdos! 2. Kodolu frakcijas iegūšana no audu šūnu kultūras 2. 1. Šūnu iegūšana no audu šūnu kultūras suspensijas 2. 2. Kodolu frakcijas iegūšana

Limfocītu izdalīšana fikola gradientā PIRMS PĒC B - asinis F - fikols P - asins plazma, trombocīti W - limfocīti R - eritrocīti, granulocīti http: //hipc. stanford. edu/sops/pbmc-isolation-accuspin-conical-method