Centre Wallon de Biologie Industrielle PROCEDES POSTFERMENTATION DOWNSTREAM

Centre Wallon de Biologie Industrielle PROCEDES POST-FERMENTATION DOWN-STREAM PROCESSING Université de Liège - Faculté Universitaire des Sciences Agronomiques de Gembloux 1

Objectifs principaux des opérations en aval des fermenteurs a. Obtenir un taux de récupération élevé du produit recherché avec le moins possible de contaminants (attention, ne pas confondre taux de récupération élevé et pureté élevée – la pureté d’un produit est une notion variable liée à la nature du produit et à son économie). b. Mettre en œuvre des techniques fiables, s’adaptant à de faibles variations dans la nature et les propriétés physicochimiques du flux à traiter 2

Moût fermenté Microorganismes et insolubles Elimination des insolubles Produit en solution Extraction Impuretés Produit dilué Concentration Produit concentré Purification Produit pur Fig. 1. 1. Diverses phases de l’extraction d’un produit extracelllulaire 3

Moût fermenté Récupération des cellules Milieu Rupture des parois cellulaires Elimination des insolubles Extraction Parois cellulaires Impuretés Produit dilué Concentration Purification Produit pur Fig. 1. 2. Diverses phases de l’extraction d’un produit intracellulaire 4

Caractéristiques des moûts de fermentation -Concentration faible -Biodégradabilité (enzymes, microorganismes) Substances Concentration (g/l) Glucose Ethanol Acides organiques (ac. acétique, citrique, …) a-amylase Antibiotique Riboflavine Vitamine B 12 Glutamate de sodium Acétone-alcool butyrique Lipide SCP 50 70 -120 40 -150 20 4 -30 10 -15 0. 02 35 18 -20 10 -30 30 -50 Tabl. 1. 1. Concentration typiques de produits de fermentation dans les bouillons de fermentation 5

Disruptions cellulaires Opération « brutale et délicate » Disruption mécanique Ultrasons : actuellement petits volumes bruits 6

Presse de French et homogénéisateur Fig. 1. 3. Schéma de la presse de French Fig 1. 4. Configuration de la vanne de décharge d’un homogénéisateur du type Manton-Gaulin 7

La suspension cellulaire est placée dans le cylindre, vanne fermée. Après mise en place du piston, l’appareil est retourné, la vanne ouverte et l’air contenu dans le cylindre est expulsé. La vanne est alors refermée et l’ensemble placé sur une presse hydraulique puissante qui, par l’intermédiaire du piston, soumet la suspension à une pression importante (généralement supérieure à 1000 kg/cm 2). La vanne à aiguille est à nouveau ouverte et la suspension est littéralement extrudée au travers de cet orifice. Ce système présente divers inconvénients : - Un échauffement parfois important du milieu (risque de dénaturation des substances biochimiques) - Une capacité très réduite (volume traité en une fois de l’ordre de 50 ml, débit à travers la vanne de l’ordre de quelque ml par minute) - Système discontinu 8

Au niveau industriel, les homogénéisateurs de type Manton-Gaulin, sont les appareils les plus répandus pour la disruption cellulaire. Ils se composent pour l’essentiel, d’une pompe haute-pression équipée d’une vanne à orifice de décharge ajustable. Lilly et ses collaborateurs ont étudié les performances d’un tel système pour la disruption d’une levure de boulangerie. Ils ont montré que la disruption cellulaire, mesurée par la proportion de protéines solubles libérées, était indépendante de la concentration en levure, était proportionnelle au nombre de passes dans l’appareil et dépendait de la pression opératoire. 9

En fait, ils ont mis en évidence la loi suivante : R 2. 9 Log ----- = K N P Rm Où R = proportion de protéines solubles libérées Rm = proportion maximale de protéines solubles libérables (ici 96 mg par g de levure) N = nombre de passes P = pression K = constante dépendant de la configuration de la vanne de décharge et de la température 10

Moulins à billes Divers types de moulins à billes, notamment utilisés dans l’industrie de la peinture, ont été testés pour la disruption cellulaire. Ces appareils sont généralement constitués d’une chambre cylindrique comportant un arbre central équipés de plateaux cylindriques régulièrement espacés. Les espaces annulaires compris entre les plateaux, le rotor et la paroi de l’appareil sont partiellement remplis de billes dont la granulométrie peut varier d’une chambre à l’autre. Ce sont ces billes qui constituent l’agent de broyage proprement dit. A- cylindre B- agitateur C- séparateur D- moteur 1&2 entrée et sortie des cellules 3&4 refroidissement agitateur 5&6 refroidissement du cylindre Fig. 1. 5. Moulin à bille de Netzsch LM-20 11

Pression La presse-X due à Ebedo se compose d’un cylindre divisé en deux parties séparées par un disque percé d’un petit orifice. Une pâte cellulaire gelée est forcée un grand nombre de fois au travers de l’orifice entre les deux parties du cylindre. La disruption cellulaire qui en résulte est probablement due à la déformation des organismes enrobés de glace (la glace subit lors du passage de l’orifice des modifications cristallines). Cet appareil est uniquement utilisé au laboratoire. 12

Fig. 1. 6. Schéma de la presse –X de Ebedo 13

Disruption non mécanique La lyse physique Les méthodes physiques de lyse cellulaire sont essentiellement des techniques de laboratoire. Ainsi, le refroidissement et la congélation lente de cellules suivis de leur dégel (rupture de l’enveloppe cellulaire par des cristaux de glace) se révèle en pratique une technique lente, coûteuse et peu efficace. Plus prometteuse mais encore inutilisé industriellement est la technique du choc osmotique qui pourrait, dans certaines conditions, conserver les cellules sous un forme viable tout en les forçant à relâcher certaines enzymes de façon sélective. 14

La lyse chimique Certains détergents anioniques et cationiques, des alcalis et divers solvants endommagent sérieusement les composants lipoprotéiques de la membrane cellulaire conduisant à la lyse cellulaire. Ces agents chimiques cependant dénaturent généralement par la même occasion le matériel endocellulaire. Seul l’extraction de composés particulièrement résistants peut être envisagée par ces techniques. L’emploi d’antibiotiques (tyrocidine, amphotéricines) permet d’accroître la perméabilité cellulaire des bactéries mais l’emploi de ces agents est fort limité à cause de leur coût. 15

La lyse enzymatique Le lysosyme et d’autres enzymes du même type sont capables de provoquer la lyse des bactéries gram-positives et, sous certaines conditions, de bactéries gram-négatives. Certains antibiotiques (pénicilline, …) peuvent interférer dans les étapes de synthèse des parois cellulaires conduisant à des cellules anormales particulièrement faciles à lyser. Ces techniques prometteuses sont gravement handicapées par le coût des agents utilisés. 16

Séparations liquide-solide Faisant suite à la disruption cellulaire, si elle a été effectuée, la première étape du traitement des bouillons de fermentation consiste généralement en une séparation liquide-solide dont le but peut être : -de séparer le ou les produits recherchés des autres composés indésirables tout en opérant une réduction importante du volume à traiter; -d’éliminer les débris cellulaires résultant de la disruption avant d’extraire le ou les produits intracellulaires recherchés. On en facilite ainsi la concentration et la purification en évitant, par exemple, le colmatage des membranes d’ultrafiltration ou des colonnes d’adsorption; -de récupérer les cellules en tant que biomasse pouvant être utilisée comme source de protéines (SCP), comme pied de levain dans l’industrie alimentaire ou encore lors du démarrage de l’épuration biologique de certaines eaux résiduaires; -D’éliminer, par lavage multiétagé les traces de divers substrats indésirables… 17

Différentes techniques Décantation Centrifugation Filtration Ultrafiltration Moussage 18

Sédimentation Lors de la sédimentation, deux forces verticales agissent sur les particules (que nous considérons sphériques et de diamètre uniforme) : pdp 3 -la force de gravité Fg = (rp – rf) g ------6 -la force résultant du frottement visqueux fluide-particule pdp 2 V 2 FD = CD ----- rf ------2 4 avec CD = coefficient de traînée de la particule * V = vitesse verticale relative fluide-particule *Le coefficient de traînée dépend du régime hydrodynamique de l’écoulement vertical – voir cours de génie chimique. Généralement, en sédimentation, on se trouve dans le régime de Stokes : 24 24µf Re rf. Vdp CD = -------- 19

La vitesse de sédimentation, ici la vitesse terminale de chute libre, est atteinte lorsque les deux forces verticales agissant sur la particule s’équilibrent : 2 pdp 3 Vg Fg = FD => (rp – rf) g ------- = CD ----- rf ------2 4 6 rp-rf D’ou en régime de Stokes : Vg = ----- g dp 2 18 µf Il est clair que la vitesse de sédimentation, dont dépend directement les performances du sédimenteur, est liée à l’intensité de la force volumique (gravité) agissant sur les particules. D’où l’idée d’accroître artificiellement cette force en plaçant le flux à sédimenter dans un champ d’accélération supérieur à celui de la pesanteur et plus particulièrement dans un champ d’accélération centrifuge. 20

Décantation Bien que la sédimentation classique dans le champ de la pesanteur soit peu utilisée en biotechnologie (sauf en épuration des eaux), il est utile d’en rappeler les principes car ils sont à la base de la définition des critères d’extrapolation pour la sédimentation centrifuge. Considérons le cas de la sédimentation discrète idéale dans un tank ayant la forme d’un parallélépipède droit. On définit, pour un type de particules donné (dp, rp), un débit critique Qc qui est celui pour lequel 50% des particules de type considéré auront sédimenté dans le tank; On montre facilement que : Qc = 2 Vg A Où Vg = vitesse de sédimentation dans le champ de la pesanteur A = aire du tank de sédimentation 21

Fig. 1. 7. Sédimentation idéale dans un tank parallélépipédique 22

Fig 1. 8. Décanteur à traction par câbles 23

Notions de sédimentation centrifuge Rappelons qu’une particule animée d’un mouvement circulaire plan autour d’un point est soumise à une accélération centripète g: Où g = 2 r = vitesse angulaire de rotation r = distance de la particule au centre de rotation On caractérise parfois une telle accélération en nombre de G 2 r G = -----g Dans un sédimenteur centrifuge, un bol tournant à grande vitesse entraîne la masse liquide qu’il contient dans un mouvement de rotation à vitesse angulaire quasi-identique à la sienne. L’inertie des molécules liquides est généralement suffisamment petite pour qu’elles ne dévient pas de leurs trajectoires circulaires. Par contre, si le liquide contient des particules solides, celles-ci verront se superposer au mouvement circulaire d’entraînement, un mouvement radial tendant à les éloigner du centre de rotation. 24

Dans le sens radial, les particules sont soumises à deux forces : une force centrifuge due à l’accélération et une force centripète correspondant aux frottement visqueux. La vitesse de sédimentation correspond à l’égalité de ces forces : 2 2 pdp 3 pd V p (rp – rf) ---- 2 r = CD -----g 2 6 4 D’où, en régime de Stokes : rp-rf 2 Vs = ----- r dp 2 18 µ f La notion de débit critique Qc peut aussi être induite pour des sédimenteurs centrifuges et on écrit classiquement par analogie avec l’expression obtenue en sédimentation discrète dans le champ de la pesanteur : Qc = 2 Vg S Où Vg = vitesse de sédimentation dans le champ de la pesanteur 25 S = facteur sigma du sédimenteur centrifuge

Le facteur sigma du sédimenteur centrifuge correspond physiquement à la surface A d’un sédimenteur classique fonctionnant dans le champ de pesanteur terrestre et qui aurait les mêmes performances que le sédimenteur centrifuge considéré. Les deux principaux types de sédimenteurs centrifuges utilisés industriellement sont la centrifugeuse à bol circulaire et la centrifugeuse à disque. Pour ces deux types d’appareils, le facteur sigma s’écrit respectivement : 2 pb Sbc = ----- (3 r 22 + r 12) 2 g 2 p(N-1)(r 3 b-ra 3) 2 Scd = -------------2 g t Idéalement, la notion de facteur sigma devrait fournir un élément chiffré de comparaison entre des centrifugeuses de tailles et de types différents. 26

Malheureusement, l’établissement des équations se base sur nombre d’hypothèses simplificatrices qui ne sont, en pratique, que partiellement applicables aux machines réelles (sédimentation discrète, couche mince, …) On s’accorde cependant pour dire que le facteur sigma fournit un critère relativement correct d’extrapolation pour des centrifugeuses d’un même type : * Il faut cependant être fort prudent et notamment n’appliquer S 2 * la formule que pour des centrifugeuses ayant des vitesses de rotation peu différentes. Sinon, il faut corriger le facteur Qc 2 = Qc 1 ---d’extrapolation ( « scale-up factor » ) S 1 Remarquons en outre que la sédimentation centrifuge est, en principe, favorisée par des particules de grand diamètre, une grande différence de densité entre fluide et solide et une faible viscosité du solide. Nous savons, malheureusement, que les particules biologiques sont généralement à l’opposé de ces critères. La sédimentation de telles particules est dès lors difficile et impose des vitesse angulaires élevées et des centrifugeuses de rayon aussi grand que possible. Ces facteurs sont cependant limités par la tenue des matériaux. 27

Equipements de sédimentation centrifuge La centrifugeuse la plus simple se compose d’un simple bol tubulaire suspendu à un moteur par l’intermédiaire d’un accouplement flexible. Le guidage se fait par le bas à l’aide d’une garniture constituée d’un métal doux, souvent du laiton. (Bien qu’il n’y ait, en principe, aucun contact entre la solution à centrifuger et ce métal, des contaminations au cuivre sont parfois observées avec des liquides contenant des sels d’ammonium). Ce type de centrifugeuse se rencontre surtout au niveau du laboratoire ou du pilote. Son fonctionnement est discontinu (la décharge des solides implique l’arrêt du système). On trouve des modèles fournissant des accélérations comprises entre 15000 et 50000 g environ. Le liquide est introduit axialement par le bas du bol. Les solides sédimentent sur le bol tandis que le surnageant est récolté au sommet du bol (attention au moussage et à la formation d’aérosol). 28

Fig. 1. 9. Centrifugeuse à bol circulaire 29

A l’échelle industrielle, c’est la centrifugeuse à disque qui est l’appareil le plus universellement répandu. Le liquide est introduit dans la centrifugeuse à travers son axe central, il ressort par le sommet de l’appareil après avoir traversé le jeu de cônes. L’espacement faible entre ceux-ci favorise la sédimentation rapide des solides qui glissent sur la surface des cônes et quittent la centrifugeuse par des orifices percés à la périphérie du bol. Fig. 1. 10. Centrifugeuse à disques 30

Un dernier type d’équipement est la centrifugeuse à bol tubulaire et à vis. Il s’agit d’un type de centrifugeuse particulièrement adapté aux solides collants qui risqueraient d’obstruer rapidement les orifices des centrifugeuses à disques. La vis d’Archimède intérieure au bol tourne à une vitesse inférieure à ce dernier et racle les solides sédimentés qui sortent dans la partie tronconique de l’appareil. Fig 1. 11. Centrifugeuse à bol tubulaire et à vis 31

Fig 1. 12. Bol clarificateur à chambres concentriques (Westfalia) Fig 1. 13. Centrifugeuse à disques et bol autodébourbeur à ouverture par piston (Alfa Laval) 32

Filtration D’une façon générale, il faut savoir que les liquides de fermentation ne sont pas très faciles à filtrer en raison notamment de la viscosité du milieu, de la taille et de la nature des microorganismes. Les gâteaux biologiques sont souvent très compressibles de sorte qu’un accroissement de la pression de filtration ne se traduit parfois que par un gain transitoire en débit de filtrat suivi rapidement d’une chute importante de ce débit. La nature filamenteuse ou collante de divers microorganismes conduit souvent au colmatage rapide de la toile filtrante. Pour toutes des raisons, il est courant d’utiliser des adjuvants de filtration tel le Kieselguhr. Si ces adjuvants sont très utiles lorsque le produit recherché se trouve en phase liquide, ils ne sont pas sans inconvénients. 33

Non seulement les cellules ou les débris cellulaires mêlés au Kieselguhr ne peuvent plus être utilisés pour l’alimentation animale, mais les adjuvants utilisés adsorbent parfois sélectivement certaines enzymes que l’on veut récupérer. En filtration batch, le filtre-presse classique est l’équipement le plus courant dans l’industrie biotechnologique (débâtissage automatique) En filtration continue, le filtre rotatif sous vide avec décharge soit à couteau soit à fil est le plus répandu. Pour certaines applications spécifiques, des filtres sous pression à décharge centrifuge (Funda) sont parfois utilisés. 34

Fig 1. 14. Filtre-presse 35

Fig 1. 15. Filtre sous vide, à bande sans fin 36

Fig 1. 16. Filtre à tambour rotatif, en enceinte fermée, sous pression 37

Flottation La séparation se fait dans un liquide contenant des particules solides en suspension, comme par exemple des cellules microbiennes. Ces dernières se fixent sur les bulles d’un gaz qui se forment dans la suspension. La flottation des particules adhérentes aux bulles permet de les éliminer sous forme de mousse. Pratiquement, on injecte un gaz au fond du fermenteur. Comme les moûts ont une constitution hétérogène, il se forme de la mousse à l’interface gaz-liquide. Si l’on a ajouté des antimousses au cours de la fermentation, on doit prévoir un apport de substances tensioactives. Les mousses doivent avoir un rapport gaz/liquide élevé pour que, la mousse une fois cassée, on ait aussi peu de liquide, très enrichi en cellules microbiennes. 38

Substance cassant la mousse Mousse cassée riche en cellules bactériennes liquide gaz Substance tensio-active Fig 1. 17. Représentation schématique d’une séparation de cellules par flottation Ce procédé est appelé microflottation. Le rapport entre la concentration des particules dans la mousse cassée et celle de la suspension d’origine définit le facteur de concentration. On exprime plutôt les résultats sous forme d’un rapport d’enrichissement tenant compte du nombre de particules dans le même volume de liquide restant après enlèvement de la mousse. Ce rapport augmente lorsqu’on ajoute des substances qui favorisent la fixation des particules aux bulles (amidons ioniques, chlorure de cétylpyridinium, 39 sels minéraux, détergents cationiques).

La microfiltration et l’ultrafiltration tangentielle sur membrane Les biotechnologies exigent de plus en plus des techniques de séparation fines; on désire descendre de plus en plus souvent sous le micron et parfois même jusqu’à quelques angström. Le tableau ci-dessous reprend la classification des différentes techniques de séparation sur membrane. Technique Taille des particules Pressions mises en oeuvre Microfiltration (MF) 0. 02 à 10 microns 1 à 5 kg/cm 2 Ultrafiltration (UF) Osmose inverse (RO) Macromolécules d’un PM > 500 Daltons Molécules, ions d’un PM < 500 Daltons 1 à 10 kg/cm 2 10 à 60 kg/cm 2 40

Les principaux types de membranes Membranes homogènes : ces membranes possèdent une structure poreuse identique sur tout leur épaisseur. Leur utilisation est surtout réservée à la microfiltration car la taille des pores est trop importante pour les autres techniques. Cette structure très fine sur toute l’épaisseur entraînerait une perméabilité. Membranes asymétriques : ces membranes présentent une couche très dense et très fine (0. 2 à 2 micron) qui réalise la séparation. Cette couche est supportée par une structure macroporeuse (100 à 200 microns) beaucoup plus perméable ce qui permet d’obtenir des débits de perméation beaucoup plus élevés. Membranes écrans : ces membranes sont constituées d’une fine pellicule de polycarbonate (15 microns) percée de pores bien calibrés. 41

La microfiltration tangentielle Les membranes de microfiltration sont des membranes relativement poreuses et symétriques. Elles comportent des pores plus ou moins cylindriques dont le diamètre moyen est défini avec grande précision. Le seuil de coupure de ces membranes est en principe précisément défini par la taille moyenne des pores (par ex : 0. 22 µm ou 0. 45 µm). On peut distinguer trois grand types commercialisés. Les fibres Millipore préparés à partir d’esters de cellulose ou de polymères fluorés selon un procédé qui n’est pas connu. La microstructure de ces filtres ressemble à une éponge mais la dimension des pores est ajustée avec grande précision. L’épaisseur moyenne des membranes de ce type est d’environ 100µm. Leur porosité est élevée, environ 80%. 42

Les filtres Nucleopore constitués d’un film de polycarbonate dense irradié à l’aide de fragments de fission d’Uranium 235. La trace laissée par la trajectoire de chaque particule donne naissance à un pore après traitement à la soude. Pour éviter la superposition des pores qui donnerait une dispersion importante des diamètres des pores, le nombre de pores et donc la porosité de la membrane sont limités drastiquement (e = 10%). Cependant, comme les pores sont des capillaires parfaitement rectilignes et que la membrane est de faible épaisseur (10µm) le débit nominal de ces filtres est équivalent à celui des filtres Millipore, de l’ordre de 10. 000 à 50. 000 l/h m 2 bar. Les membranes Celgard sont formée à partir de films extrudés de polypropylène. Au cours de l’extrusion du polymère, les lamelles microcristallines en formation se placent parallèlement les unes aux autres. Le film ainsi obtenu est alors étiré. Au cours de cette opération, les lamelles sont écartées les unes des autres et donnent naissance à une structure poreuse très caractéristique. Les pression d’utilisation de ces membranes sont de l’ordre de quelques bars. Récemment sont apparues des membranes minérales (alumine frittée, oxyde de Zirconium sur support de carbone) d’une haute 43 résistance chimique et thermique.

Les appareils appelés généralement perméateurs ont été décrits dans le cours de technique de séparation et de concentration des produits. Rappelons les différents types : perméateurs à membranes planes, perméateurs à membranes tubulaires, perméateurs à fibres creuses, perméateurs à membranes spiralée. Fig. 1. 18. Module plan 44

Fig 1. 19. Ceramic element cutaway. Membrane is inside 3 mm circular channels Fig. 1. 20. Configuration monolithe ou multicanal 45

Fig. 1. 21. Modèle tubulaire : vue latérale et vue en coupe Fig. 1. 22. Module fibre creuse 46

solution pressurisée (A), (B) rétentat membrane solution (B) Fig. 1. 23. Diagramme schématique du procédé d’ultrafiltration sur membrane 47

Le nettoyage et la désinfection de la filtration à membranes La percée de la technologie de membranes et la diversification constante des différents domaines d'application, ont fait que les facteurs de procédés et les conditions d'utilisation se sont optimalisées progressivement. Malgré cette évolution, il est primordial pour la détermination du rendement de la filtration à membranes, que les procédures de nettoyage et de désinfection soient exécutées en respectant les prescriptions du fabricant avec le plus grand soin. Les résidus logeant sur les membranes, suite à un nettoyage insuffisant ou mauvais ont pour conséquence, une diminution du temps de procédé et de capacité. Une désinfection inadéquate a énormément d'influence sur la qualité de production. 48

Principaux facteurs relatifs au nettoyage des installations de filtration La dureté de l’eau : non pas pour le nettoyage, mais plutôt pour le rinçage, il est indispensable que l'eau soit conforme à la loi. En outre, il existe des limitations relatives à la teneur des éléments chimiques tels que : le fer, le managenèse et le silicate. Le temps de nettoyage : Le plus important dans la phase de nettoyage, c'est le temps de contact entre le produit de nettoyage et les résidus. Le temps de nettoyage diffère en fonction de la nature du produit chimique. La température de nettoyage : L'augmentation de la température améliore l'effet du nettoyage. En général, on choisit pour les résidus de graisse, une température supérieure à la température de fusion. 49

Le profil et la vitesse du courant : L'épaisseur de la membrane secondaire - formée par la polarisation de concentration en surface de séparation laminaire de la membrane - dépend du rapport entre la vitesse et la pression appliqués. Les résultats de nettoyage sont d'autant plus efficaces que la pression est basse et que la vitesse du courant est haute. L’influence de la nature du produit de nettoyage : Il est bien connu que pour l'élimination des résidus organiques, on utilise les produits alcalins tandis que pour les matières inorganiques, les produits acides. Pour améliorer l'effet de nettoyage - spécialement pour les résidus de graisse, protéines ou autres substances organiques, on ajoute des mouillants et des complexants en différentes combinaisons en phase alcaline. Le choix de la procédure de nettoyage dépend de l'application en question. 50

Critères en cas de mauvais fonctionnement Pour chaque application et même pour chaque installation, il y a divers phénomènes qui peuvent contribuer au mauvais fonctionnement du nettoyage des membranes. En tous cas, il faut : - éviter l'injection d'air dans la solution de nettoyage - utiliser des produits de nettoyage spécifiques - désinfecter l'installation après et avant la production 51

Parois Cellules . . . Rupture cellulaire Extraits. . . Traitement thermique Séparation solide/liquide Milieu de fermentation (moût) 52

Concentration et purification Concentration Ultrafiltration Précipitation Osmose inverse Evaporation Distillation Purification Résine échangeuse d’ions Chromatographie d’affinité Précipitation Cristallisation Solvant 53

Ultrafiltration Concentration 10 X Voir membranes (autres parties) 54

Précipitation Sels : (NH 4)2 SO 4 : précipitation fractionnée Très polluant Na 2 SO 4 Solvant : acétone, éthanol, méthanol, isopropanol Ancienne technique peu utilisé Précipitation des polymères haut poids moléculaires Principe : les polymères de hauts poids moléculaires sont avides d’eau et ils déshydratent les macromolécules en jouant sur des interactions stériques avec leurs groupements hydrophiles. Polymères : dextran, polyéthylène glycol (PEG) Récupération du polymère : par passage sur une résine séphadex Précipitation : point isoélectrique (peu utilisé) sauf pour les métabolites (acide aminés) 55

Osmose inverse Solution concentrée eau - concurrence de l’évaporation (multiples effets ou simple effet (voir sucrerie)) - avantages : - température basse -Moins d’énergie -Coût des membranes élevé 56

Résines échangeuse d’ions Théorie : vue ailleurs - résines anioniques ou cationiques solution Fixation sur résines conditionnées reconditionnement Décrochage par action du p. H ou force ionique Solution enzymatique ou métabolique Utilisé pour les enzymes ou les métabolites 57

Chromatographie d’affinité Principe : sur une matrice insoluble, sont fixé des ligands spécifiques du produit à purifier dont on a pris soin de préserver le(s) caractère(s) d’affinité pour celui-ci. Le produit est fixé sur la matrice par interaction avec le ligand. On utilisera un éluant qui aura une plus grande affinité pour le produit que le ligand ou on jouera sur des conditions de milieu pour diminuer l’affinité entre le ligand et le produit. Exemple d’applications : - Purification d’enzymes : le ligand peut être un cofacteur ou un analogue du substrat - Purification de glycoprotéines : le ligand peut être une lectine (protéine ayant la capacité de se fixer spécifiquement à un résidu glycosidique) - Purification d’antigènes : le ligand peut être un anticorps (l’inverse est également possible) 58

Autres chromatographies Chromatographie d’adsorption non spécifique Principe : les molécules sont séparées en fonction de leur affinité surfacique pour l’adsorption (souvent l’hydroxyapatite) Chromatographie hydrophobe Principe : les molécules sont séparées en fonction de leur capacité à interagir avec des groupements hydrophobes fixés sur une matrice. 59

Extraction par solvant L’extraction liquide-liquide est une technique bien connue en génie chimique. Elle est utilisée assez couramment dans l’industrie biochimique et plus spécialement dans la production des antibiotiques. L’extracteur Podbielniaky est souvent rencontré. Notons que les techniques d’extraction sont aussi très souvent utilisées pour des productions à petite échelle (appareil de Craig…) Remarquons enfin que se développent depuis quelques années des techniques d’extraction liquide-liquide utilisant deux phases aqueuses immiscibles (dextran + Polyéthylène glycol). Ces techniques pourraient se révéler utiles pour séparer des enzymes où autres espèces chimiques sensibles ne supportant pas les solvants organiques. 60

Distillation Colonne à plateaux 61

Cristallisation - Opération très performante - Métabolite (acide glutamique, lysine, saccharose) - Peu coûteuse 62

Conditionnement final du produit - Sous forme liquide - Sous forme solide 63

Sous forme liquide -Facile à manipuler pour les industriels -Maintenir la stabilité du produit -Antimicrobiens (acide sorbique, …) -Anti-protéases (protéines, viscosité (polyol, glycol, …)) -Stabilisateur de la structure (glycérol, substrats, …) 64

Sous forme sèche -Atomisation -Lyophilisation -Fluidisation 65

Enzymes à 10 euros le kilo Moût. . . ultrafiltration x 10 Produits finis liquide ou atomisation (solide) additifs Centrifugation filtration Cellules (déchets) 66

Enzymes à 100 - 250 euros le kilo Moût. . . R. E. I. solution liquide atomisation Centrifugation filtration Cellules (déchets) 67

Enzymes à 500 - 2000 euros le kilo ultrafiltration. . Centrifugation. . filtration chromatographie d’affinité lyophilisation atomisation Cellules (déchets) parois cellules. . . Centrifugation. . . filtration broyage chromatographie d’affinité lyophilisation Moût atomisation 68

Métabolites à 3 - 5 euros le kilo moût. . . Centrifugation. . . filtration évaporation précipitation solubilisation Cellules (déchets) cristallisation Produits finis Acide glutamique lysine 69

Métabolites à 20 - 25 euros le kilo moût. . . Centrifugation. . . filtration Extraction par solvant Cellules (déchets) évaporation séchage précipitation Antibiotique 70