Cell Biology Experiment 2018 Week 13 Quantitative Realtime

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 Week # 13 Quantitative Real-time PCR Cel. Tech Laboratory Department of Genetic Engineering Sungkyunkwan University

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 Purpose Cancer cell이 injection 된 mouse에서 VEGF & CEA의 발현양은? c. DNA synthesis q. RT-PCR Normal mouse (Negative control)의 VEGF & CEA 보다 몇 배 ( 많다 / 적다 )

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 SYBR Green 1) Denaturation F F Primer 2) Primer annealing F polymerase F F F 3) Extension F F F Fluorescent dye F F

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 Taq. Man probe 1) Denaturation F Q Quencher 2) Primer annealing / Probe hybridization Q F 3) Extension F Q

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 Melting curve

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 q. RT-PCR Data Analysis Delta Ct method Delta (∆) : 변화량 Delta (∆ ∆) : 변화량을 비교 1) ∆Ct = Target gene (VEGF or CEA) – House Keeping Gene (GAPDH) : 전체 RNA양을 동일하게 하기 위해서 2) ∆∆Ct = Cancer ∆Ct – Negative control ∆Ct : Negative 에 비해 target gene의 발현양이 얼마나 되는지

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 Threshold Ct (Threshold cycle) A Baseline Cycle 수 B C 형광 signal Threshold cycle ( Ct ) Threshold 18 24 32 Cycle 수

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 예시 2 Negative control Cancer cell injection GAPDH VEGF 형광 signal VEGF 18 Negative 각 유전자의 Ct? 24 32 Cycle 수 36 GAPDH = 18 VEGF = 36 Negative의 ∆Ct = Target gene Ct – H. K. G Ct = 36 – 18 = 18 Cycle 수 Cancer 각 유전자의 Ct? Cancer 의 ∆Ct = Target gene Ct – H. K. G Ct = 32 - 24 =8 ∆ ∆Ct = Cancer ∆Ct – Negative ∆Ct = 8 - 18 = -10 GAPDH = 24 VEGF = 32

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 예시 ( 계속 ) ∆ ∆Ct = Cancer ∆Ct – Negative control ∆Ct = -10 의미? ? ? 형광 signal PCR 증폭 산물 양 Ex. ∆ ∆Ct 값 비교 초기의 DNA 시료 내 target gene의 양 24 23 22 21 20 21 22 23 * PCR을 통해 1 cycle 마다 증폭되는 DNA양은 2배이다. Cancer injection에서 VEGF의 m. RNA 발현양이 Negative control 보다 몇 배 더 많을까? Cancer injection에서 210 배 더 많이 발현 Cycle 수

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 q. RT-PCR Data Analysis Delta Ct method

세포생물학실험 Cell Biology Experiment 2018 Protocol * Primer : GAPDH, VEGF, CEA * q. RT- PCR mixture * q. RT- PCR cycle • Template 2 μl • Primer - Forward primer 1 μl - Reverse primer 1 μl ② 95℃, 10 sec / Denaturation Real time PCR용 pre-mix ( 4 X ) 5 μl ③ 60 ℃ (57 ℃), 15 sec / Annealing • ( SYBR green, Taq polymerase, buffer, d. NTP ) • D. W 11 μl Total vol. : 20 μl ① 95℃, 10 min / Hot start 단계 ④ 72 ℃, 20 sec / Extension