CATABOLISMO DELLEME E DIAGNOSTICA DELLE IPERBILIRUBINEMIE 1 La

CATABOLISMO DELL'EME E DIAGNOSTICA DELLE IPERBILIRUBINEMIE 1

La precisa conoscenza della biochimica dei pigmenti biliari è indispensabile per poter interpretare correttamente i test di laboratorio che ne riflettono il metabolismo La bilirubina (il principale pigmento biliare) è il prodotto terminale del catabolismo dell’eme. . Il gruppo eme deriva principalmente dal catabolismo dell’emoglobina (85 -90%) e, in misura minore, dal catabolismo della mioglobina, dei citocromi e di enzimi eminici come la catalasi (10 -15%) Ciclo vitale degli eritrociti 120 giorni I globuli rossi invecchiati vengono riconosciuti e fagocitati dai macrofagi del sistema reticolo endoteliale della milza, del fegato e del midollo osseo (emocateresi). L’emoglobina liberata viene scissa nella componente proteica, la globina, e nel gruppo eme. 2

FORMAZIONE della BILIRUBINA dall’EME I I II IV III =CH- metenilico –CH=CH 2 vinile V; –CH 2 -COOH propionile P; –CH 3 metile. M 3

EME OSSIGENASI Fe 3+ II IV Riciclato I BILIVERDINA RIDUTTASI bilirubina V = vinile –CH=CH 2; P = propionile –CH 2 -COOH; M = metile –CH 3. Queste reazioni avvengono nei macrofagi del sistema reticolo endoteliale della 4 MILZA, ma anche fegato e midollo

5

There are three known isoforms of heme oxygenase. Heme oxygenase 1 (HO-1) is an inducible isoform in response to stress such as oxidative stress, hypoxia, heavy metals, cytokines, etc. Heme oxygenase 2 (HO-2) is a constitutive isoform that is expressed under homeostatic conditions. Both HO-1 and HO-2 are ubiquitously expressed and catalytically active. A third heme oxygenase (HO-3) is not catalytically active, but is thought to work in oxygen sensing.

In addition to the physiological substrate heme, HO-1 responds to induction by a wide variety of stimuli associated with oxidative stress. Such inducing agents include hypoxia, hyperoxia, cytokines, nitric oxide (NO), heavy metals, ultraviolet-A (320– 380 nm) radiation, heat shock, shear stress, hydrogen peroxide, and thiol (-SH)-reactive substances. The multiplicity of toxic inducers suggest that HO-1 may function as a critical cytoprotective molecule. Many studies have suggested that HO 1 acts as an inducible defense against oxidative stress, in models of inflammation, ischemia-reperfusion, hypoxia, and hyperoxia-mediated injury. The mechanisms by which HO-1 can mediate cytoprotection are still poorly understood. All three products of the HO reaction potentially participate in cellular defense 7

La bilirubina rilasciata in circolo si lega all’albumina (quest’ultima ha due siti di legame, uno ad alta affinità ed uno a bassa) e raggiunge il fegato dove viene coniugata nei microsomi dell’epatocita (il trasporto della bilirubina all’interno dell’epatocita avviene tramite uno specifico trasportatore, la ligandina) 8

REAZIONE DI CONIUGAZIONE III IV Bilirubina di-glucuronide (idrosolubile) Questa molecola si forma nei microsomi dell’ epatocita per azione della bilirubina: UDP-glucuronil trasferasi (isoforma UGT 1 A 1) Bilirubina + 2 UDP-glucuronato bilirubina-diglucuronide + 2 UDP Secreta nella Bile per trasporto attivo 9

Esistono 2 forme di BILIRUBINA : - NON CONIUGATA o INDIRETTA: è la bilirubina che si forma nei macrofagi del sistema reticolo endoteliale. E’ liposolubile e raggiunge il fegato legata all’ALBUMINA - CONIUGATA, DIRETTA o DIGLUCURONIDE, idrosolubile, si forma nei microsomi dell’epatocita ed è secreta per trasporto attivo nei canalicoli biliari partecipando alla formazione della BILE (secrezioneesocrinadelfegatodicoloreverdeformatada bilirubina, sali biliari, colesterolo, fosfolipidi, ioni inorganici e una quota limitata di proteine) Individui normali: Bilirubina totale ematica 0, 2 -1, 1 mg/d. L Bilirubina coniugata o diretta ematica 0 -0, 2 mg/d. L 11

Diazo-reazione di Van den Bergh. La bilirubina diglucuronide o coniugata viene anche denominata BILIRUBINA DIRETTA in quanto, essendo idrosolubile, reagisce direttamente con il DIAZOreattivo di Van den Bergh producendo un prodotto colorato utilizzato per la sua determinazione. La bilirubina non coniugata viene denominata INDIRETTA in quanto la sua reazione con il diazoreattivo è possibile solo dopo l’aggiunta, alla miscela di reazione, di alcool o altri composti (pr es. caffeina-sodio benzoato) che la dissociano dall’albumina e la solubilizzano. In pratica la concentrazione della bilirubina INDIRETTA si ricava sottraendo la bilirubina DIRETTA dalla bilirubina TOTALE Bil. TOTALE - Bil. DIRETTA = Bilirubina INDIRETTA Attualmente si usano metodi automatizzati basati sulla diazoreazione che utilizzano diazoreattivi stabili 12

La BILIRUBINA CONIUGATA, DIRETTA o DIGLUCURONIDE secreta con la BILE raggiunge l’INTESTINO dove viene idrolizzata ( -glucuronidasi) e ridotta (enzimi batterici) in UROBILINOGENO, prodotto incolore e solubile. Quest’ultimo può imboccare tre vie: - la quota maggiore nell’intestino CRASSO viene ossidata a STERCOBILINA (molecola che conferisce il colore bruno alle feci). - una piccola quota, riassorbita a livello intestinale, ritorna al fegato attraverso il circolo portale e risecreta (Circolo entero-epatico dei bilinogeni). - una piccola quota, non riassorbita dal fegato, immessa nella circolazione sistemica (vena epatica) viene eliminata con le urine attraverso i reni dove viene ossidata in UROBILINA. 13

Bilirubina: UDP-glucuronil trasferasi Eme ossigenasi Biliverdina reduttasi Circolo enteroepatico dei bilinogeni -glucuronidasi - Riduzione da parte degli anaerobi intestinali urobilinogeno Ossidazione spontanea nell’intestino crasso FORMAZIONE E TRASPORTO DEI PIGMENTI BILIARI 14

Schema generale della FORMAZIONE DEI PIGMENTI BILIARI Sistema reticolo-endoteliale di fegato, milza e midollo Catabolismo dell’emoglobina Globina (7 g/die) Eme EME Ferro riciclato (7 mg/die) Bilirubina indiretta (250 mg/die) FEGATO Bile (glucuronidi della bilirubina) Rene Urobilina (0, 5 -3, 5 mg/die) Intestino Circolazione entero-epatica Stercobilina (230 mg/die) 15

Gli ITTERI Le situazioni di iperbilirubinemia che si manifestano clinicamente con colorazione gialla più o meno intensa delle sclere e della cute prendono il nome di itteri (bilirubinemia > 2 mg/d. L); sub-ittero: solo colorazione gialla delle sclere e della mucosa sublinguale; - Si distinguono tre tipi di ittero: 1. Ittero pre-epatico o emolitico (accumulo di bilirubina indiretta nel sangue); 2. Ittero epatico o epatocellulare (accumulo di bilirubina sia diretta che indiretta nel sangue); 3. Ittero post-epatico o colestatico (accumulo di bilirubina glucuronata nel sangue). 16

1. Ittero pre-epatico: - aumentata distruzione di globuli rossi, - aumenta la quota di bilirubina indiretta o non coniugata legata all’albumina perché il fegato non è in grado di captare e coniugare l’eccesso di bilirubina. stercobilinogeno. Itteri iperemolitici: anemie emolitiche EREDITARIE o ACQUISITE (ad es. favismo, sferocitosi, emoglobinopatie, incompatibilità Rh materno-fetale, farmaci, trasfusioni incompatibili); 17

2. Ittero epatico o epatocellulare iperbilirubinemie non coniugate ereditarie: difetti della coniugazione. 1. sindrome di Crigler-Najiar, CN, autosomica recessiva, incapacità di coniugazione per mancanza della bilirubina: UDP-glicuronil trasferasi, UGT 1 A 1. CN 1: iperbilirubunemia neonatale molto grave: assenza di attività dell’enzima da mutazioni nonsense o frameshift con formazione di proteina tronca. Bilirubinemia > 26 mg/d. L Neurotossicità CN 2: iperbilirubinemia neonatale più lieve: perdita parziale dell’attività dell’enzima da mutazioni missense Bilirubinemia < 20 mg/d. L raramente determina encefalopatia 2. sindrome di Gilbert, forma benigna parziale riduzione dell’attività UGT 1 A 1 lieve iperbilirubinemia cronica che fluttua da valori normali sino a 5 mg/d. L variante del promotore che lo rende meno efficiente: la TATA box contiene dinucleotidi TA ripetuti in tandem sequenza normale A(TA)6 TAA. Ripetizioni più lunghe del dinucleotide (TA)7 o (TA)8 sono associate con minore efficienza del promotore. 18

2. Ittero epatico o epatocellulare iperbilirubinemie coniugate ereditarie: difetti della secrezione biliare incapacità a secernere la bilirubina coniugata nei canalicoli biliari per difetto nel trasporto 1. sindrome di Dubin-Johnson da difetto di un trasportatore canalicolare multispecifico per gli anioni organici: ABCC 2. 19

2. Ittero epatico o epatocellulare iperbilirubinemie acquisite Difetti secondari della captazione, glucuronazione e secrezione canalicolare della bilirubina in numerose epatopatie tossiche o infettive acute e croniche. 20

3. Ittero post-epatico o colestatico aumentata quantità di bilirubina coniugata o diretta nel sangue dovuta ad un’ostruzione delle vie biliari che determina un reflusso del pigmento biliare nel circolo ematico. La bile ha difficoltà a raggiungere il duodeno. Le cause della colestasi possono essere di natura intraepatica, associata a lesioni dell’epatocita: - epatiti virali, alcoliche - steroidi progestinici di sintesi, per meccanismi tossici sulle vie biliari - fenotiazine per precipitazioni intracanalicolari - cirrosi biliari primitive e secondarie - colangite su base tossica e batterica; o extraepatica : - calcoli o carcinoma del dotto biliare comune o dell’ampolla di Vater - atresia dei dotti extraepatici - compressione tumorale estrinseca, per carcinoma della testa del pancreas, linfonodi e cisti. 21

In caso di COLESTASI si ha un aumento nel circolo ematico di - bilirubina coniugata, sali biliari (colalemia), colesterolo ed - alcuni enzimi sierici: 1. Fosfatasi alcalina ( forma billiare ALP-1, 90 -280 U/l) 2. -glutamiltranspeptidasi ( GT, < 55 U/l) 3. 5’- Nucleotidasi (5’-NT) 4. leucin aminoacil-peptidasi (LAP) 22

FINE 24