Caracterizacin del procesamiento del receptor de muerte DR

Caracterización del procesamiento del receptor de muerte DR 6 N. Artime , L. Cabal-Hierro, E. del Valle, J. M. Iglesias, P. Casado, M. A. Prado, L. Ugarte, S. Ramos, P. S. Lazo Dpto de Bioquímica y Biología Molecular. Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias. Universidad de Oviedo. Resumen DR 6 es un receptor de muerte de la superfamilia TNFR, la cual se caracteriza por poseer dominios ricos en cisteína (CRD) en su región extracelular. DR 6 posee cuatro CRDs y una larga región espaciadora en la región extracelular. Esta región se sitúa entre los CRDs y la región transmembrana y es característica de este receptor. Al igual que los otros receptores de muerte, está descrito que DR 6 es capaz de inducir apoptosis, aunque esto depende de la línea celular, así como de activar a JNK y a NF-κB [1]. No obstante, se desconocen las vías de señalización que conducen al desencadenamiento de estas tres respuestas, las moléculas adaptadoras implicadas, y la regulación de estas respuestas. Recientemente se ha descrito que DR 6 es procesado proteolíticamente por la metaloproteasa MT 1 -MMP en células tumorales [2], y en nuestro laboratorio hemos determinado que el receptor expresado por células HEK 293 transfectadas transitoriamente también es procesado proteolíticamente, siendo este proceso dependiente de señales intracelulares desencadenadas por el propio receptor, si bien éstas se desconocen actualmente [3]. En este trabajo mostramos que el procesamiento de DR 6 en las células HEK 293 es sólo parcialmente inhibido por ilomastat, un inhibidor general de metaloproteasas, incluso a concentraciones diez veces superiores a las habitualmente utilizadas, sugiriendo que varias proteasa pueden estar procesando a DR 6 en estas condiciones. Además, podemos descartar el papel de la metaloproteasa MT 1 -MMP en el procesamiento de DR 6 en células HEK 293, ya que este proceso no se inhibe al bloquear la activación de la metaloproteasa mediante el tratamiento con un inhibidor de la furina, proteasa encargada de la activación de la MT 1 -MMP, y por demostrar la falta de expresión de esta metaloproteasa en las células HEK 293. También demostramos que el procesamiento de DR 6 tiene lugar en la larga región espaciadora situada entre los CRDs y las región transmembrana, ya que la deleción de esta región genera un receptor funcional pero que no es procesado. Utilizando las células de carcinoma de pulmón A 549, que presentan alta expresión de DR 6, mostramos que el procesamiento de DR 6 endógeno en estas células es dependiente del TNF, sin que se observe un aumento en la expresión del receptor o de la metaloproteasa MT-MMP. Materiales y Métodos Líneas celulares, transfección transitoria y tratamientos. Las células HEK 293 (ATCC CRL-1573) se crecieron en MEM (Lonza) suplementado con 10% FBS inactivado por calor, 1% de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 1% de L-Glutamina (Sigma-Aldrich), 100 U/ml de penicilina (Sigma-Aldrich) y 0, 1 U/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich). Las transfecciones se realizaron en placas de 6 pocillos utilizando el policatión polietilenimina. Los complejos de transfección se preparan mezclando 2, 5 μg de DNA con 4, 25 μl de PEI en medio MEM con 1% de aminoácidos. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 1530 minutos, tras lo cual se añade gota a las células, que se incuban durante 5 horas a 37 ºC. Tras ese tiempo, se cambian el medio de las células por medio completo, y se trata con el inhibidor indicado, ilomastat (Calbiochem) o Inhibidor de furina II (Calbiochem) a las concentraciones indicadas en cada caso. Las células A 549 (ATCC CCL-185) se crecen en DMEM HAM’s F-12 suplementado con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 0, 1 U/ml de estreptomicina. Análisis western. A las 48 h de la transfección, se recogen los sobrenadantes del cultivo, se centrifugan a 13. 000 rpm durante 15 minutos a 4ºC para eliminar posibles restos celular y se concentran utilizando un microcón YM-10 (Millipore). Las muestras se corren en un gel SDS-PAGE al 10 % y se transfieren a PVDF. Las membranas se bloquean con TBS con 1% de Tween y 3% de leche desnatada en polvo, tras lo cual se incuban con el anticuerpo (anti-FLAG (Sigma-Aldrich) 1: 5. 000 para el receptor sobreexpresado y anti-DR 6 (Abcam) 1: 1. 000 para DR 6 endógeno) diluido en TBS-T durante toda la noche a 4ºC. Se lavan las membranas 3 veces con TBS-T durante 5 minutos, tras lo cual se incuba con el anticuerpo secundario conjugado a HRP (anti-Ig. G de ratón 1: 10. 000 de Sigma-Aldrich o anti-Ig. G de conejo 1: 5. 000 de Cell Signaling). Tras una hora de incubación se realizan tres lavados de 5 minutos y uno de 10 minutos y se revela utilizando el sistema de ECL de Amersham. Extracción del RNA, transcripción reversa y PCR. Para la extracción del RNA se utilizó el reactivo TRI (Sigma-Aldrich) según las especificaciones de la casa comercial. La transcripción reversa se realizó utilizando 2 μg de RNA y con el enzima M-MLV Transcriptasa reversa de Invitrogen según las indicaciones. Para analizar la expresión por RT-PCR, se amplificó un fragmento de unos 200 pb utilizando la polimerasa Go. Taq (Promega) en un termociclador Gene. Amp PCR System 2400 (Applied Biosystem). Para las reacciones de Q-PCR, se utiliza Power Sybr Green (Applied Biosystem) según las indicaciones de la casa comercial utilizando … 7000 (Applied Biosystem). Como control interno se utiliza el gen de la β-actina. Resultados El procesamiento de DR 6 es inhibido sólo parcialmente por altas concentraciones de ilomastat. Las células HEK 293 transfectadas con un plásmido que codifica el receptor completo son tratadas con 10 μM de ilomastat y 48 horas después los medios de cultivo son analizados por western utilizando un anticuerpo dirigido frente al epítopo FLAG, situado en la región extracelular del receptor. Utilizando esta concentración de inhibidor, no se observa ningún tipo de inhibición en el procesamiento de DR 6 (Fig 1 A). Por ello, decidimos realizar un experimento de dosis/respuesta, aumentando la concentración de inhibidor hasta 100 μM (sin observarse cambio en la viabilidad del cultivo), lo que supone 10 veces más alta que la utilizada normalmente. De esta forma comprobamos que el procesamiento es inhibido parcialmente a partir de una concentración de inhibidor de 40 μM, sin llegar a producirse en ninguna de las concentraciones ensayadas una inhibición total (Fig 1 B). Por tanto, podemos afirmar que en el procesamiento de DR 6 sobreexpresado en células HEK 293 intervienen al menos dos proteasas, una sensible a ilomastat y otra insensible. MT 1 -MMP no interviene en el procesamiento de DR 6 en células HEK 293. Puesto que está descrito que MT 1 -MMP es capaz de procesar proteoliticamente a DR 6, decidimos estudiar si esta metaloproteasa está implicada en este proceso en las células HEK 293. MT 1 -MMP es activada por la proprotein convertasa furina, de forma que si inhibimos la actividad de esta convertasa, inhibimos la activación de la MT 1 -MMP. Por ello, tratamos las células HEK 293 transfectadas transitoriamente con un plásmido que codifica al receptor completo con el inhibidor de furina II a dos concentraciones distintas: 10 μM, que es la concentración usualmente utilizada, y 100 μM, lo que supone 10 veces más que la concentración habitual (Fig 2 A). De esta forma comprobamos que la inhibición de la furina no tiene ningún efecto sobre el procesamiento de DR 6, lo que nos sugiere que la MT 1 -MMP no está implicada en este proceso. Para confirmarlo, analizamos la expresión a nivel de m. RNA de MT 1 -MMP en las células HEK 293, comprobando que esta metaloproteasa no se expresa en dichas células (datos no mostrados). Por lo tanto, podemos afirmar que MT 1 -MMP no está implicada en el procesamiento de DR 6 sobreexpresado en células HEK 293. Mapeo del sitio de corte. Como primera aproximación para determinar el sitio de corte en el receptor, generamos una deleción entre los aminoácidos 239 -345, lo que supone delecionar la región espaciadora entre los CRDs y la región transmembrana que, como se ha mencionado anteriormente, es característica de DR 6 (Fig 3 A). Al analizar los medios de cultivo de células HEK 293 transfectadas transitoriamente con un plásmido que expresa el receptor completo y un plásmido que expresa el receptor truncado, comprobamos que la deleción de la región 239 -345 inhibe el procesamiento de DR 6 (Fig 3 B). Por tanto, el procesamiento de DR 6 tiene lugar entre los aminoácidos 239 y 345. Además, hemos comprobado que este receptor truncado es funcional, comportándose de manera similar a DR 6 en cuanto a la activación de JNK y NF-κB (datos no mostrados). Procesamiento de DR 6 endógeno en células A 549. Para comprobar que DR 6 también es procesado sin necesidad de ser sobreexpresado ectópicamente, decidimos estudiar este proceso en unas células que expresaran altos niveles de receptor. Es por ello que elegimos las células de carcinoma de pulmón A 549. Puesto que está descrito que el TNF es capaz de aumentar la expresión de DR 6 en células LNCa. P mediante un proceso dependiente de la activación de NF-κB, decidimos estudiar el efecto que esta citoquina tiene en el procesamiento de DR 6 en estas células. Para ello tratamos las células A 549 con 10 ng/ml de TNF durante 24 horas, tras lo cual analizamos los medios de cultivo mediante análisis western utilizando un anticuerpo dirigido frente a la región extracelular de DR 6 (Fig 4 A). De esta forma comprobamos que DR 6 es procesado proteolíticamente en células A 549 cuando se tratan con TNF, pero no en el control no tratado. Para comprobar si la inducción del procesamiento se debía a un aumento de la expresión del receptor y o la metaloproteasa MT 1 -MMP, tratamos las células con 10 ng/ml de TNF durante los tiempos indicados, tras lo cual se recogen y se extrae el RNA. Mediante PCR cuantitiva, estudiamos los niveles de expresión de DR 6 y MT 1 -MMP, utilizando como control positivo del tratamiento la propia inducción de TNF por el propio TNF. De esta forma comprobamos que ni DR 6 ni MT 1 -MMP aumentan sus niveles de m. RNA (Fig 4 B). Por tanto, la inducción del procesamiento de DR 6 en las células A 549 es independiente de un aumento en la expresión de la metaloproteasa MT 1 -MMP o del propio receptor. A. Control B. DR 6 k. Da Concentración ilomastat (μM) 25 30 40 50 75 100 A. DR 6 k. Da 109, 5 Control DR 6 ΔEc 1 A. k. Da 78, 9 Control TNF 60, 4 78, 9 ΔEc 1 B. 47, 2 35, 1 60, 4 47, 2 Ilomastat 10 μM 47, 2 - - μM 0 10 μM 10 nt ro l Co 60, 4 Figura 2. Las células HEK 293 transfectadas con un plásmido que codifica el receptor DR 6 completo fueron tratadas con inhibidor de furina II a las concentraciones indicadas y los medios de cultivo fueron analizados como se describe en la figura anterior, Como puede observarse, el inhibidor de furina II no inhibe el procesamiento de DR 6 a la concentración recomendada (10 μ M) o a altas concentraciones (100 μM) B. 47, 2 + Figura 1. (A) Las células HEK 293 transfectadas con un plásmido que codifica el receptor DR 6 completo o un vector control fueron tratados con ilomastat 10 μM, y los medios condicionados fueron analizados 48 horas después de la transfección mediante análisis western utilizando un anticuerpo anti-FLAG, epítopo situado en la región extracelular del receptor. Como puede observarse, a esta concentración el ilomastat es incapaz de inhibir el procesamiento de DR 6. Por ello, se realizó el mismo ensayo utilizando mayores concentraciones del inhibidor (B). De esta forma se pudo comprobar que el ptrocesamiento de DR 6 en células HEK 293 es inhibido únicamente de forma parcial a altas concentraciones de ilomastat. 78, 9 60, 4 Figura 3. (A) Representación esquemática de DR 6 y del receptor truncado al que se le han delecionado los aminoácidos 239 -345. Se representan los dominios ricos en cisteína en morado, los dos posibles motivos de unión a TRAF en rojo y el dominio de muerte en negro. (B) Análisis western de los medios de cultivo de células HEK 293 transfectadas con un plásmidos control, el plásmido que codifica DR 6 completo y el plásmido que codifica el receptor truncado. El análisis se realizó tras 48 horas de la transfección utilizando un anticuerpo anti-FLAG como se describe en Materiales y Métodos. Bibliografía. [1] Pan G. et al. Identification and functional characterization of DR 6, a novel death domaincontaining TNF receptor. FEBS Lett. 1998 Jul 24; 431(3). [2] De. Rosa D. C. et al. Tumor-derived death receptor 6 modulates dendritic cell development. Cancer Immunol Immunother. 2008 Jun; 57(6). [3] Artime N. et al. Functional analysis of death receptor-6 (DR 6). Activation of JNK and regulation of receptor shedding. Figura 4. (A) Análisis western de los medios de cultivo de células A 549 sin tratar (control) o tratadas con 10 g/ml de TNF utilizando un anticuerpo dirigido frente a la región extracelular de DR 6. Como puede comprobarse, el TNF induce la aparición de la región extracelular de DR 6 en el medio de cultivo. (B) Análisis de la expresión de DR 6 y MT 1 -MMP mediante Q-PCR (se utiliza como control positivo del tratamiento la inducción del TNF por el propio TNF). Se puede comprobar como el TNF no induce la expresión de DR 6 ni de MT 1 -MMP.