Cara Mempelajari Sel A Teknik Mikroskopi cara visual

Cara Mempelajari Sel A. Teknik Mikroskopi cara visual 1. Mikroskop cahaya biasa (compound microscope) digunakan untuk melihat obyek 0, 2 – 0, 8 m. Mikroskop cahaya biasa menggunakan 2 lensa i. e. obyektif & okuler. Resolving power (RP) mikroskop cahaya sesuai dg sinar yang dikoleksi lensa (obyektif).

RP : kapasitas/kemampuan untuk mendiferensiasi 2 titik yang terpisah. RP mata manusia 100 m dapat mendiferensiasi 2 titik berjarak 100 m. Sel hewan & bakteri mempunyai diameter 10 – 20 m tidak dapat didiferensiasi mata biasa diperlukan alat bantu (kaca pembesar/mikroskop) untuk memperkuat RP. RP mikroskop cahaya 0, 2 – 0, 8 m dapat digunakan melihat bakteri atau mitokhondria dg. diameter 0, 5 m. Mikroskop elektron, RP 2 – 4 nm digunakan melihat partikel & organel yang lebih kecil.

Hasil diferensiasi suatu mikroskop sehingga dihasilkan gambar/bayangan yang baik/jelas/nyata disebut resolusi Resolusi suatu mikroskop dipengaruhi/tergantung pada : - panjang gelombang sinar ( ) yang digunakan - index refraksi sinar (n) yang melewati sediaan/ obyek, tergantung media yang meneruskan sinar dari obyek ke lensa obyektif, dapat diperbesar dengan memberi oli emersi, air, dsb. - aperture (sin ) ½ sudut sinar datang/dikoleksi lensa obyektif; aperture maximum pada 70 sin 70 = 0, 94 Resolusi (D) = c. n. sin c = konstanta (0, 61)

Preparasi sel/sediaan yang diamati dengan mikroskop biasa Sel/jaringan yang akan diamati struktur & topografinya dalam organ dibuat statis sel dimatikan, diimobilisasi & diawetkan. Sel difiksasi dimasukkan ke larutan fiksatif (asam dan/atau organik) - alkohol - formaldehid - glutaraldehid Setelah difiksasi sel/jaringan dibuat dalam ketebalan tertentu supaya dapat melewatkan sinar dengan baik (4 – 8 m). Sel diembed dalam supporting medium : wax, paraffin embedding tissue dipotong dengan mikrotom dan diexpose (letakkan) pada permukaan gelas obyek (glass slide).

Pewarnaan sel/jaringan Sel diwarnai dengan zat warna agar dapat dibedakan bagian sel satu dari yang lain. Zat warna tertentu mempunyai afinitas terhadap sel/komponen tertentu sehingga bagian yang lebih berafinitas ke zat warna tsb tampak berbeda dari organel/ komponen sel yang lain. Ex : hematoxylen (asam) berafinitas ke molekul/protein basa yg terdapat dalam jumlah besar di nukleus. Eosin (basa) berafinitas ke molekul-molekul asam di sitoplasma.

sel yang diwarnai HE nukleus biru & sitopl. merah Pewarnaan spesifik digunakan untuk mawarnai bagian-bagian spesifik sel. Ex: feulgen methylen blue comassie blue peryodat Schiff janus green - DNA (nukleus) - protein - karbohidrat - mitokhondria

Beberapa modifikasi mikroskop cahaya 1. Mikroskop fluoresensi Digunakan utk melihat struktur/molekul spesifik dlm sel. Sel (spesimen) diwarnai dg fluoresen bagian sel yang menyerap fluoresen akan berfluoresensi. Molekul yang berfluoresensi menyerap cahaya dengan energi tinggi (UV) dan memancarkannya kembali pada energi yang lebih rendah (visible). Ex: - khromosom Y berafinitas pada quinakrin membentuk F body yang berfluoresensi. - Ab dikonjugasikan dengan fluoresen & diikatkan dengan Ag spesifiknya dalam sel struktur yang mengandung Ag tsb akan berfluoresensi.

2. Mikroskop fase kontras Biasa digunakan utk melihat sel dlm keadaan hidup/utuh Bila sinar melewati sel/bagian sel, sinar tsb akan berubah fase sesuai index refraksi sel. Ex : cahaya yang melewati bagian padat (nukleus) akan berubah fase relatif dari bagian sekitarnya. Perubahan fase akan diinterferensikan oleh alat (ring phase).

Interferensi cahaya satu fase memperkuat lebih terang. Interferensi cahaya berbeda fase saling meniadakan lebih redup. Gambaran sel : daerah sekitar/luar sel - terang di dalam sel - sitoplasma redup nukleus lebih gelap Sel redup dengan latar belakang terang.

B. Teknik Biokimia Cara Analitik Tujuan : Mempelajari sel pada tingkat molekul untuk memahami fungsi dan peran molekul tsb dalam mengkonstruksi sel atau komponen sel. Prinsip : Mengisolasi atau memisahkan molekul dari sel, dan mengujinya berdasarkan sifat-sifat fisik, biologi dan kimianya. Metoda dasar (prinsip kerja) : 1. Memecah/menghancurkan sel/jaringan menjadi bagian-bagian kecil atau fragmen sel. 2. Purifikasi/pemisahan komponen sel. 3. Menganalisa struktur dan fungsi fragmen-fragmen tsb pada tingkat molekul

Memecah/fragmentasi sel : Bervariasi, tergantung struktur dan karakter sel. 1. RBC mudah sekali dihancurkan dengan larutan hipotonus 0, 075 M KCl, aquadest. 2. Sonikasi memberi kejutan dengan getaran menggunakan sonikator Satuan getaran = Hz (hertz) 3. Enzim lisozim menghancurkan dinding sel bakteri.

4. Deterjen : a. nonionic detergent mild detergent, menghancurkan membran, nukleus & organel tidak rusak - triton - nonidet b. cationic detergent melarutkan membran sel - c. TAB - DOC c. Anionic detegent merusak semua organel sel - SDS 5. Homogenizer: untuk menghancurkan jaringan yg kuat - teflon homogenizer - electric homogenizer

Purifikasi/Pemisahan komponen sel : 1. Sentrifugasi Pemisahan komponen sel berdasarkan perbedaan kecepatan sedimentasi. Komponen-komponen sel akan tersedimentasi karena mendapat daya sentrifugal yang dihasilkan oleh perputaran rotor. Homogenat sel berisi partikel-partikel molekul/ fragmen sel dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi suspensi partikel dlm tabung sentrifugasi diputar partikel sel akan tersedimentasi ke dasar tabung.

Kecepatan sedimentasi yang diperlukan untuk mengendapkan suatu partikel tergantung pada : - Massa partikel (berat/g) - Kecepatan putaran rotor dinyatakan dalam rpm (revolution/rotation per minute). rpm tergantung pada kecepatan sudut rotor ( = radial/dt). Suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan tertentu dihasilkan : pellet (presipitat) super natan

1. Sentrifugasi diferensial (differential centrifugation) — Liver homogenate 600 g x 10’ supernatan pellet : sel, nukleus, debris jar. 1200 g x 15’ supernatan pellet : mitokhondria 14. 000 g x 20’ supernatan pellet : lisosom 15. 000 g x 60’ supernatan (sitosol) pellet mikrosom

2. Sentrifugasi densitas bertingkat (density gradient centrifugation). Sucrose gradient Tabung sentrifugasi diisi sukrose dg konsentrasi bertingkat. Konsentrasi sukrose pekat didasar, makin berkurang (encer) di bagian atas. Bila suspensi sel ditaruh dipermukaan medium dan disentrifugasi tiap fraksi akan tersedimentasi pada densitas/kepekatan tertentu. Fraksinasi terjadi karena perbedaan daya geser (frictional force) yang didapat tiap fraksi pada medium dg densitas berbeda.

Molekul dg BM besar tertahan di bag. Atas; molekul dg BM kecil tersedimentasi lebih ke dasar (mengalami friction lebih kecil). Sucrose gradient sensitif utk memisahkan protein dan organel sel. Cs. Cl gradient Medium terdiri dari larutan garam Cs. Cl yg mempunyai densitas tinggi (50 – 60%) & viskositas rendah. Digunakan utk memisahkan molekul yg mempunyai struktur/bentuk sama dengan BM berbeda. Sensitif untuk memisahkan DNA/RNA.

2. Khromatografi Prinsip : Suspensi molekul dipisahkan oleh 2 fase/faktor yang tidak dapat bercampur/bergabung (nonimiscible phase) fase stasioner/diam (stationary phase) & fase mobil (mobile phase) Pemisahan terjadi karena perbedaan afinitas molekul yg dipisahkan terhadap fase stasioner dan fase mobil.

Macam khromatografi 1. Khromatografi kertas (paper chrom. ) Utk memisahkan molekul-molekul kecil spt nukleotida, peptida & as. amino. Menggunakan kertas selulose sbg media penunjang (supporting medium). Fase stasioner — air yg membasahi kertas Fase mobil — pelarut nonpolar, bergerak lebih cepat pada kertas selulose, mis. : n-butanol Suspensi yg akan dipisahkan diteteskan pada salah satu ujung kertas (dlm l) & dikeringkan ujung kertas dg noda sampel dicelupkan ke dlm bejana berisi air & butanol terjadi partisi

2. Khromatografi lapisan tipis (thin layer chrom. ) Supporting medium — lempeng kaca fase stasioner — selulose / silica gel dilapiskan pada permukaan kaca, berfungsi sbg “adsorption material”. fase mobil — campuran nonpolar CHCl 2 & CH 3 OH. Sampel diteteskan pada sumur di ujung plate dicelupkan ke fase mobil molekul yg sukar teradsorpsi akan bergerak lebih cepat terbawa oleh pelarut nonpolar

3. Column chromatography — khromatografi menggunakan kolum (tabung). A. Filtrasi gel : memisahkan komponen sel berdasarkan perbedaan ukuran (BM) molekul. Partikel gel dari bahan selulose (sephadex) yg memp. pori dg ukuran tertentu diisikan ke dalam kolum & sampel yg akan dipisahkan dilewatkan pada kolum dg larutan bufer. Fase stasioner — bufer dalam partikel gel. Fase mobil — bufer diluar partikel gel. Bila suspensi sel dilewatkan kolum : - partikel besar berada diluar gel & terbawa keluar kolum oleh bufer lebih cepat. - partikel sedang — sebagian masuk & sebagian di luar gel - partikel kecil — semua masuk ke pori-pori gel & keluar kolum paling akhir.

B. Ion exchange chromatography (khromatografi pertukaran ion). Pemisahan komponen sel berdasarkan perbedaan muatan listrik (ion) molekul yang dipisahkan. Kolum diisi ion exchanger — partikel bermuatan yang diikat pada suporter : selulose polystiren divinil benzene sephadex fase stasioner — partikel bermuatan pada ion exchanger fase mobil — bufer dengan p. H bertingkat atau konsentrasi garam bertingkat

Keeratan hubungan molekul dengan exchanger tergantung pada besarnya muatan pada molekul dilepaskan dari exchanger dengan 2 cara : - Meningkatkan ionic strength dg meninggikan konsentrasi garam pada bufer menyebabkan rusaknya ikatan elektrostatik antara exchanger dg molekul yang dipisahkan. - Mengubah p. H bufer : p. H tinggi menetralkan anion p. H rendah menetralkan kation

3. Elektroforesis Memisahkan komponen sel/molekul bermuatan (protein, nukleotida) atau yang diberi muatan. Prinsip : molekul bermuatan di dalam medan listrik akan bermigrasi ke elektroda yang berlawanan. Supporting medium : gel agarose gel poliakrilamid kertas selulose gel agarose dan akrilamid dibuat dengan konsentrasi/ persentase tertentu untuk mengatur ukuran porus. Sampel dimasukkan ke dalam sumur pada salah satu ujung gel plate.

Elektroforesis

Bila sampel dlm media ditaruh dalam bejana berisi bufer elektrolit & dihubungkan ke power supply terjadi partisi karena migrasi molekul bermuatan ke elektroda yang berlawanan. Kecepatan migrasi menentukan partisi, tergantung pada: - besar muatan - ukuran molekul - bentuk (shape) molekul

Analisis fraksi sel 1. Teknik Spektroskopi Prinsip : Molekul / ikatan kimia cenderung mengabsorpsi energi. Sinar adalah suatu gelombang elektromagnetik yang menghasilkan energi Energi yang dilepaskan sinar (radiant energy) tergantung pada . h = Plan’k constant 6. 6256 x 10 -34 J. dt v = frekuensi radiasi = c. 1/ c = 2. 998 x 108 m. s-1 E = h. c energi yg dihasilkan sinar berbanding terbalik dg panjang gelombangnya E = h. v

Komponen spektrofotometer : - lampu tungsten & halogen menghasilkan sinar visible & UV. - wave selector mengubah sinar polichromatik menjadi sinar monochromatik, menseleksi sinar dg yang dikehendaki. - slit (celah) mengarahkan cahaya pada obyek yang diamati. - tabung sampel/cuvett tempat untuk menaruh sampel yang diukur, dibuat dari gelas khusus yang mempunyai absorbancy sangat kecil. - photo tube mengubah sinar yang keluar dari sampel menjadi arus listrik. - detector/scaler alat pencatat besarnya sinar yg keluar dari sampel.

Besarnya energi (sinar) yang diabsorpsi dapat diukur dg spektrofotometer.

Kegunaan spektroskopi 1. Mengidentifikasi molekul yang belum diketahui. Setiap molekul mempunyai spektrum absorpsi yang khas, gambaran absorpsi yang bervariasi tergantung yang dipakai. Ex : asam nukleat mempunyai max = 260 nm protein dg gugus aromatik = 280 nm protein dg ikatan peptida lurus = 212 nm 2. Mengukur kuantitas/konsentrasi molekul dlm larutan. Besar sinar yang diabsorpsi sebanding dengan konsentrasi molekul yang diukur.

Hubungan konsentrasi molekul dan absorpsinya diterang kan dengan Hukum Beer & Lambert. Log I 0 /I (OD) = k. c. l I 0 = intensitas sinar datang (insidence light) I = intensitas sinar yang meninggalkan sampel OD k c l = optical density = extinction coefficient = konsentrasi molekul yang diukur dlm molar (m). = panjang medium yang dilewati sinar dlm cm (lebar cuvett).

2. Penggunaan isotop Isotop : - atom dengan jumlah elektron sama tetapi mempunyai jumlah neutron berbeda. - mempunyai sifat kimia sama, tetapi sifat fisika berbeda. Manfaat : Isotop yang berbeda dapat mengadakan reaksi yang sama dalam satu sistem biologi, karena mempunyai sifat kimia yang sama. Eksistensi molekul yang mengandung isotop (label) dapat ditelusur berdasarkan sifat fisikanya yang berbeda dari atom/molekul dalam sistem tsb.

C. Teknik Biakan Sel — Teknik Biologi Digunakan untuk mempelajari fisiologi, biokimia, morfologi, genetika dari sel. Dlm teknik ini sel ditumbuhkan dalam media kultur in vitro. Media kultur yang digunakan mula-mula (1912) adalah media alamiah (natural) : - serum binatang — sapi muda biri-biri - ekstrak embrio

1952, mulai dibuat media sintetik terdiri dari pelarut (bufer), berisi faktor-faktor diperlukan utk pertumbuhan sel : - sumber energi — karbohidrat, lipid - bahan pembagun(building block) — peptida, nukleotida - kofaktor — vitamin, ion-ion anorganik - molekul karier — serum - stimulator — hormon dll. Didisain komposisinya sesuai dengan kebutuhan sel dan tujuan percobaan.

Dalam percobaan mikrobiologi sel yang ditumbuhkan dalam media kultur dapat : - lebih dari satu spesies (mix culture) kultur langsung dari isolat atau utk mempelajari simbiosis/interaksi antar sel. - terdiri dari satu spesies (pure culture) kultur yang dimurnikan atau dipindahkan dari mix culture. Pada organisme multiseluler sel terorganisasi membentuk jaringan, antara sel satu dengan yang lain dihubung kan oleh adhesion molecules dari protein organ dipotong kecil-kecil & diberi tripsin untuk melepaskan sel dari jaringan. Sel yang dikultur adalah sel tunggal tumbuh & berproliferasi membentuk selapis (monolayer) sel.

Kultur sel yang diambil langsung dari jaringan hewan/ manusia disebut kultur primer (primary culture), biasanya terdiri dari bermacam-macam sel (mixed culture). Sel dari kultur primer dapat dipindahkan ke media kultur baru; prosesnya disebut subkultur atau replating kultur baru disebut kultur sekunder (secondary culture); subkultur dapat dilakukan berkali-kali setiap pemindahan disebut satu pasasi (passage). Banyaknya pasasi tergantung dari: umur individu spesies tingkat deferensiasi

Kultur fibroblast dari : - embrio manusia umur 4 bulan 50 pasasi - dewasa 15 – 20 tahun 30 pasasi - dewasa s/d 40 tahun 20 pasasi - Werner’s syndrome < 10 pasasi - jaringan tumor tidak terbatas Di dalam kultur sel akan berproliferasi membentuk monolayer & akan berhenti apabila 2 sel berdekatan saling bertemu (contact inhibition) kultur menjadi stabil (tidak mengalami pertumbuhan). Bila satu sel dari kultur primer disubkultur beberapa pasasi akan dihasilkan populasi sel identik disebut klon (galur sel) — prosesnya disebut cloning.

Klon sel yang dikultur dari klon terdahulu yang sudah teridentifikasi (patent), disebut established cell line Ex. He la cell line — klon sel berasal dari karsinoma servix manusia. Jurkat cell line — klon sel dari leukemia limfositik sel T BHK cell line — baby hamster kidney CHO cell line — chenese hamster ovary dsb.