Cancer du sein Statut HER 2 et IHC

Cancer du sein Statut HER 2 et IHC L’importance de la phase technique Pl@nète Roche Cancéro -1 -

Détermination du statut HER 2 par IHC et FISH/CISH Pl@nète Roche Cancéro -2 -

Oncogène HER 2, chr 17 q 1 -2 Activation par amplification Pl@nète Roche Cancéro Surexpression de la protéine -3 -

Tumeurs HER 2 (+++) Lobulaires < 5% Canalaires < 2 cm > 2 cm 10 à 15% 20 à 25% grade I 0% grade II 11% grade III 27% Cancers inflammatoires Cancers de la femme jeune Pl@nète Roche Cancéro 30% -4 -

Détermination du statut de HER 2/neu Hybridation in situ en fluorescence (FISH) et Chromogenic in situ hybridization (CISH) : amplification du gène Immunohistochimie (IHC) : expression de la protéine Pl@nète Roche Cancéro -5 -

Les cellules tumorales des cancers du sein Nombre de chromosomes anormaux +++ ( aneuploïdie) Dr AURIAS, Institut Curie, Paris HER-2: 17 q 21. 1 Pl@nète Roche Cancéro -6 -

Sur-représentation d’HER-2 des polysomies 17 des translocations déséquilibrées du 17 q 6 copies de HER 2 Dr COUTURIER, Institut Curie, Paris Translocation déséquilibrée 17 q Pl@nète Roche Cancéro -7 -

Est-ce que le statut HER 2 est stable, ou peut être acquis au cours de l’évolution tumorale ? Travail de Meng S PNAS 2004 Pl@nète Roche Cancéro -8 -

Meng S, PNAS 2004 Etude sur 33 patientes stade I à IV – Comparaison de l’amplification HER 2 dans les cellules tumorales circulantes et dans la tumeur primitive Puis même étude sur 24 patientes HER 2 - Pl@nète Roche Cancéro -9 -

Etude initiale sur 33 patientes HER 2 Le statut HER 2 est concordant pour 29 patientes (11 +/+et 18 -/-). Il est discordant pour 4 patientes présentant un statut HER 2 tumoral positif (par FISH) et négatif sur les CTC ; Pour 3 de ces patientes, un traitement par chimiothérapie et/ou Herceptin avait été instauré; faussant probablement les résultats, par la destruction des CTC HER 2 positives. Pl@nète Roche Cancéro -10 -

2ème étude sur 24 patientes HER 2 - Evaluation sur CTC chez 24 patientes initialement HER 2 « négatives » et en rechute – 9 ont acquis un statut HER 2 « positif » lors de la progression – Les 9 patientes ont alors reçu Herceptin® 2 RP et une RC Pl@nète Roche Cancéro -11 -

Critiques de l’étude Les niveaux d’amplification (rapport HER 2/chromosome 17) sont deux à trois fois plus élevés dans la tumeur initiale par rapport aux CTC. Ceci est assez troublant car l’amplification génique est un phénomène stable. Pourquoi les cellules métastatiques comme les CTC présentent des taux d’amplification plus faibles que ceux de la tumeur initiale ? Pour les CTC qui acquièrent une amplification (tumeur initiale négative), les taux sont également faibles (de l’ordre de 2. 2 soit inférieur à la valeur limite reconnue pour une amplification). Pl@nète Roche Cancéro -12 -

Pourquoi les CTC présentent elles des niveaux d’amplification si bas ? Plusieurs hypothèses se discutent : – Le statut HER 2 n’a pas été correctement évalué dans la tumeur initiale (problème technique, problème de fixation tissulaire) – La CTC présente surtout une hyperploïdie du chromosome 17 entraînant essentiellement une sur représentation de HER 2, ce qui expliquerait ces valeurs limites d’amplification – La cellule métastatique acquiert vraiment une amplification de HER 2, par sélection d’un clone HER 2+ lors des nombreux traitements reçus par ces patientes pour certaines en phase terminale Pl@nète Roche Cancéro -13 -

Conclusion Si ces résultats sont confirmés, il faudra peut être re-tester les patientes négatives sur la tumeur initiale, au niveau des métastases Pl@nète Roche Cancéro -14 -

Amplification Surexpression x 10 Cible des traitements anti HER-2 = protéine HER-2 exprimée à un haut niveau (IHC 3+) Surexpression à haut niveau d'HER-2 (3+) = liée à l'amplification du gène Les surreprésentations donnent des hyperexpressions de faible niveau Leur réponse au traitement n'est pas connue Objectif : détection des hyperexpressions/amplifications vraies Pl@nète Roche Cancéro -15 -

Détermination du statut HER-2 par FISH Technique idéale ‘’gold-standard’’ : - reproductibilité > à l'IHC - échecs identifiables (fixation BOUIN ++) - résultat sous forme d'une variable discontinue (numérique) Plusieurs limitations : - investissement en microscopie en fluorescence - coût plus élevé que l'IHC (210 €) - nécessité d'un personnel entrainé - fixation FORMOL ou Formol-Ac Acétique Indications : - calibration de l'IHC - détermination du statut des IHC 2+ Pl@nète Roche Cancéro -16 -

Hybridation in situ principe Visualisation in situ du nombre de copies d'un gène Sur coupe à partir de tissu congelé, ou fixé Lecture en référence à l'histologie, – identification des structures invasives – intérêt par rapport aux méthodes moléculaires +++ La sonde visualisée soit par l'intermédiaire . d'un fluorochrome (FISH) technique de référence . d'un chromogène (CISH) Pl@nète Roche Cancéro -17 -

FISH HER-2 2 types de kits approuvés FDA - sonde HER-2 seule (Oncor/Ventana; Zymed) n. de copies HER-2 - sonde HER-2 + cent 17 (Vysis/Abott; Dako, …) rapport copies HER-2 / copies cent 17 Un impératif : distinguer les amplifications des sur-représentations Pl@nète Roche Cancéro -18 -

FISH HER-2 amplifications sur-représentations >10 copies centromère 17 HER-2 6 copies HER-2 cent 17 Pl@nète Roche Cancéro -19 -

FISH HER-2 recommandations - HER-2 : > 6 copies - HER 2/cent 17 : > 2. 2 * Les amas de signaux (hsr) signent les amplifications. Donner les nombres de signaux HER-2 Vérifier HER-2/cent 17 en cas de 6 -7 copies HER-2 Archiver les images (contrôle de qualité) Recommandation : afin de ne détecter que les amplifications vraies seuil ratio HER 2/Cent 17 > 3 *ASCO 2006, recommandations JCO Pl@nète Roche Cancéro -20 -

Cas non amplifiés CISH Dr ARNOULD, Dijon 2 spots 5 spots Pl@nète Roche Cancéro -21 -

Cas avec amplification Pl@nète Roche Cancéro CISH Dr ARNOULD, Dijon -22 -

Faible amplification CISH Dr ARNOULD, Dijon 6 spots Vérification par FISH du centromère du chr 17 Pl@nète Roche Cancéro -23 -

Immunohistochimie : avantages Visualisation de la protéine in situ > spécificité de l’évaluation de la surexpression > quantification de la protéine cible Largement répandue Sensible Automatisable et standardisable Faible coût Polyclonaux (A 0485, Herceptest®), monoclonaux (CB 11, Pathway. TM de Ventana, SP 3 de lapin …) Pl@nète Roche Cancéro -24 -

Cas (++) Faible niveau d’amplification 8 – 10 copies du gène Pl@nète Roche Cancéro -25 -

Cas (+++) Fort niveau d’amplification > 15 copies du gène Pl@nète Roche Cancéro -26 -

IHC : inconvénients Grande sensibilité Fixation inadéquate : altération des antigènes Pas de seuil de positivité consensus Pl@nète Roche Cancéro -27 -

Concordance statut HER 2 FISH et IHC 90% Si… 1. immunohistochimie calibrée 2. nombre de cas testés par an suffisant Pl@nète Roche Cancéro -28 -

« Discordances » FISH / IHC < 10% • amplification sans surexpression • surexpression sans amplification Pl@nète Roche Cancéro -29 -

65 à 80% des cas Pas d’amplification Pl@nète Roche Cancéro Pas de surexpression -30 -

15% à 30% des cas Fort niveau d’amplification Pl@nète Roche Cancéro Surexpression forte +++ -31 -

Surexpression modérée ++ 5% des cas dont : 40% Faible niveau d’amplification 60% Pl@nète Roche Cancéro Pas d’amplification -32 -

Herceptest® (Dako) Anticorps primaire polyclonal ( A 0485) Sur tissus fixés en FORMOL neutre tamponné Réactifs prêts à l’emploi Témoins : lignées cellulaires, nombre déterminé de copies HER 2/neu Système de lecture standardisée Pl@nète Roche Cancéro -33 -

Comparaison Herceptest® / FISH Jacobs : Pauletti : Lebeau : Tubbs : Perez : Dowsett : Ainsworth : J Clin Oncol, 1999, 17, 1974 - 82 J Clin Oncol, 2000, 18, 3651 - 64 J Clin Oncol, 2001, 19, 354 - 63 J Clin Oncol, 2001, 19, 2714 -21 Mayo Clin Proc, 2002, 77, 148 -154 J Pathol, 2003, 199, 418 -423 J Clin Path 2005, 58, 1086 -1090 – positivité faible (++) – positivité forte (+++) : 6 à 87 % de faux positifs : 6 à 25 % de faux positifs Peut être une trop grande sensibilité mais la dernière version du kit donne de très bons résultats – dans le respect strict des conditions de fixation non alcoolique, – l’utilisation de témoins externes issus du laboratoire et dont le niveau d’amplification a été préalablement analysé – l’apprentissage de l’interprétation Pl@nète Roche Cancéro -34 -

Recommandations pour calibrer l’IHC sur la FISH et maintenir la concordance entre les 2 techniques Arch Pathol Lab Med, 2003, 127, p 549 Modern Path, 2003, 16, p 173 Histopathology, 2003, 42, p 337 Pl@nète Roche Cancéro -35 -

Conditions de fixation, préparation des coupes Fixation optimale – – en FORMOL neutre tamponné moins d’ 1 h après la résection chirurgicale moins de 48 h fragment de 0. 5 à 1 cm d ’épaisseur Préparation des blocs et coupes – conservation des blocs de paraffine à 20 à 25°C – réalisation des coupes idéalement moins d’une semaine avant à 20 - 25°C • au maximum 4 à 6 semaines avant la technique d’immunohistochimie à condition d’un stockage à 4°C – 3 à 5µm d’épaisseur Pl@nète Roche Cancéro -36 -

Calibration de la technique • Conditions de réaction calibrées sur • FISH • témoins • lignées cellulaires • p. H du tampon de pré-traitement (p. H : 6) • Choix de l’anticorps : monoclonal ou polyclonal • Dilution de l’anticorps primaire CB 11 : A 0485 : 1/500 à 1/800 1/500 pour le formol 1/400 pour l’AFA Adapter la dilution à chaque changement de technique, y compris entre deux automates identiques mais plus ou moins neufs (expérience de Claudius Regaud, Toulouse) Pl@nète Roche Cancéro -37 -

Témoins Utilisation de contrôles : – lignées cellulaires, fixées comme le tissu analysé – bloc multi-tissulaire (0, +++) : nombre de copies connues par FISH Bloc choisi avec tissu normal, en évitant le tissu décalcifié Faux négatifs rares si pré-traitement par la chaleur Pl@nète Roche Cancéro -38 -

Glandes normales : témoin interne négatif de réaction Augmenter la dilution de l’anticorps primaire si marquage des glandes normal Pl@nète Roche Cancéro -39 -

Maladie de PAGET témoin positif de réaction Fort niveau d’amplification Pl@nète Roche Cancéro Surexpression forte +++ -40 -

Témoin (++) amplifié (témoin intermédiaire très utile) À obtenir auprès d’un centre expert FISH Sur un des cas du laboratoire (condition de fixation et préparation des blocs identiques aux cas à tester ) Pl@nète Roche Cancéro -41 -

Calibrage de l’immunohistochimie Contrôle de qualité interne (1) • Pas de marquage des glandes normales • Coupe d’un bloc multi-tissulaire inclus à chaque manipulation : – forte amplification (forte surexpression) – amplification modérée (intensité modérée) – pas d’amplification (pas de marquage) Pl@nète Roche Cancéro -42 -

Calibrage de l’immunohistochimie contrôle de qualité interne (2) Fréquence des cas positifs : 15 à 30% Retester 5% des cas positifs et négatifs / an – CURIE en 2005: • 24 cas 3+: 100% concordance avec la FISH – 4 cas 8 copies HER 2 – 18 cas > 10 copies – 2 cas NI • 19 cas négatifs 100% concordance avec la FISH Pl@nète Roche Cancéro -43 -

En cas de surexpression de HER 2 sur la tumeur primaire Tumeur primaire Métastase HER 2+++ bronchique Pl@nète Roche Cancéro médullaire -44 -

HER 2 et récepteurs hormonaux corrélation inverse HER 2 IHC+++ ou FISH positif HER 2 négatif RO + 10 à 49% 80% RP + 8 à 24% 53% Pl@nète Roche Cancéro Lal et al Am J Clin Pathol 2005 Koneckny JNCI 2003 Taucher et al Cancer 2003 Huang et al, Annals of Oncology , 2005 -45 -

Calibrage de l’immunohistochimie contrôle de qualité externe : Résultats à vérifier par FISH / CISH Entraînement et formation du personnel Tests nationaux (AFAQAP) 1 test / an européen (UK NEQAS) 4 tests / an Pl@nète Roche Cancéro -46 -

Indications de la détermination du statut de HER 2 En 2007, idéalement : – au diagnostic initial de carcinome infiltrant (ASCP 2006) !! Ou bien : – Patientes métastatiques – N+ – N- avec critères de prescription de chimiothérapie adjuvante et/ou d’hormonothérapie adjuvante Pl@nète Roche Cancéro -47 -

En pratique Regrouper les manipulations Validation – vérification de la conformité des témoins externes, – détermination du niveau de l’intensité de la manipulation du jour ++++ Interprétation des cas par le médecin ayant signé le diagnostic. Pl@nète Roche Cancéro -48 -

Interprétations Prendre en compte – Le marquage membranaire – Le % de cellules carcinomateuses infiltrantes – L’intensité du marquage Pas de seuil validé sur la réponse au traitement Pl@nète Roche Cancéro -49 -

Le score Score Marquage Indication Herceptin 0 Absence de marquage ou < 30% des cellules non + Marquage faible et incomplet de >30% de cellules non ++ Marquage faible ou modéré et complet de >30% de cellules Oui seulement si amplification prouvée par FISH +++ Marquage fort et complet de > 30% des cellules Pl@nète Roche Cancéro oui -50 -

Surexpression hétérogène de HER 2 situation exceptionnelle TESTER LA METASTASE GANGLIONNAIRE ou VISCERALE Pl@nète Roche Cancéro -51 -

Algorithme test HER 2 IHC 10 x marquage membranaire complet non oui 20 x ou 40 x 3+ marquage membranaire complet > 30% cellules non 0 oui 2+ Pl@nète Roche Cancéro non 1+ -52 -

Algorithme général test HER 2 Tumeur mammaire FISH / CISH IHC 2+ 3+ Retester par FISH ou CISH Traitement anti HER 2 – + Traitement anti HER 2 Pl@nète Roche Cancéro HER 2/Cent 17 1, 8 2, 2 compter plus de cellules en FISH ou retester en IHC Statut HER 2 équivoque + – Traitement anti HER 2 Réf. : HERA, BCIRG, NSABP B 31, FIN HER -53 -

Conclusion HER 2 surexprimé dans ~ 15 -20% des cancers du sein Thérapeutique anti HER 2 spécifique Analyse de HER 2 par immunohistochimie APRES CALIBRAGE sur la FISH • fiable • rapide • standardisable • contrôle de qualité indispensable Pl@nète Roche Cancéro -54 -

IHC Aspects méthodologiques Pl@nète Roche Cancéro -55 -

Exemple du Protocole Curie Septembre 2006 Echantillons tissulaires fixés en AFA , coupes à 3µm Démasquage antigénique par dénaturation thermique dans 400 ml tampon citrate 10 m. M à p. H 6, 1, pendant 20’ Anticorps CB 11 (Novocastra), dilué au 1/800 – Préparation de la dilution par un référent technique, 62. 5 µl de l’AC primaire CB 11 Novocastra (ref NCL-CB 11), dans 50 ml de diluant ZYMED (ref 00 -32 -18), aliquoté en tube de 5 ml stériles , stockés à 4 ° dans le réfrigérateur de la pièce d’immunomarquage, – un aliquot est utilisé à chaque manipulation, à sortir sur GLACE pour préparation de la manipulation. – Incubation 60 min – Automate LABVISION Révélation : complexe ABC Vectastain Elite de chez Vector Contrôle externe : bloc composé de 4 tissus (3+ amplifié à plus de 10 copies, 2+ amplifié à 8 copies, 0 à 2 copies et un fragment de glandes normales) Pl@nète Roche Cancéro -56 -

Exemple du Protocole centre Jean Perrin Clermont-Ferrand Echantillons tissulaires fixés en AFA, coupes 3 µm Démasquage antigénique dans tampon citrate p. H 6. 0 (réf: Chem. Mate S 2031 Dako) pendant 40 min au Bain Marie à 97°C puis 20 min sur la paillasse à température ambiante Anticorps Ventana clone 4 B 5 prédilué (réf: 800 -2996) temps de pose de l’anticorps 28 min avec l’automate Nexes de Ventana Révélation par le kit i. View DAB Détection Ventana (réf: 760 -091) avec l’automate Nexes Pl@nète Roche Cancéro -57 -

Exemple du Protocole centre René-Huguenin Saint Cloud Echantillons tissulaires fixés en AFA, coupes 3 µm Démasquage antigénique dans tampon citrate p. H 6. 0 pendant 40 min au Bain Marie à 95°C puis 20 min sur la paillasse à température ambiante Anticorps polyclonal Dako (A 0485) temps de pose de l’anticorps 30 min, automate Autostainer Dako Révélation par le kit DAB Dako (réf: K 5001) Contrôle externe punch 3+, 2+, 0 contrôlés par Fish Pl@nète Roche Cancéro -58 -

Exemple du Protocole Institut Paoli Calmette Echantillons tissulaires fixés en FA , coupes à 3 µm Démasquage antigénique par Bain Marie(95 -99°) tampon KIT Herceptest TM p. H 6 pendant 40’, refroidir 20’ Anticorps polyclonal de lapin prédilué KIT Herceptest TM (30’) prêt à l’emploi non aliquoté Autostainer (DAKO) Révélation : DAB/KIT Contrôle externe TMA avec 3+, 2+, 0 contrôlés en FISH Pl@nète Roche Cancéro -59 -

Généralités Anticorps = Protéine de haut PM (Famille des glycoprotéines) Conformation complexe de la protéine fragilité Compromis de la fixation : morphologie et antigénicité Fixation et démasquage: un couple à optimiser Pl@nète Roche Cancéro -60 -

Durée de fixation Le délai avant fixation le plus court Durée de fixation 24 à 48 H Pl@nète Roche Cancéro -61 -

Fixation Choix du fixateur Délai de fixation Taille de l’échantillon Volume pièce / volume de fixateur Pl@nète Roche Cancéro -62 -

Fixateur Solution de formaldéhyde à 4% dans sa forme tamponnée Idéale pour FISH et IHC (pontant) A. F. A (alcool formaldéhyde, acide acétique) (coagulant) Bon compromis entre morphologie et antigénicité Pl@nète Roche Cancéro -63 -

Déshydratation-Imprégnation L’eau contenue dans les tissus sera progressivement remplacée par la paraffine (Ethanol puis Toluène ou xylène. . ) Infiltration des échantillons par la paraffine (ou mélange paraffine + polymères) à 56 -58°C (point de fusion de la paraffine !!! Attention à la paraffine trop chaude >60°C) afin préserver certaines propriétés chimiques et l’immunoréactivité Pl@nète Roche Cancéro -64 -

Séquence des solvants Ethanol 4 h Toluène 5 h Paraffine 3 h 58°C* Pour un cycle de nuit 12 h Séquence automatisée vide / pression/T° programme spécial pour le week-end en prolongeant l’étape la moins délétère : TOLUENE (12 heures ou plus) ENROBAGE en paraffine : température aussi à 58°C +++ Pl@nète Roche Cancéro -65 -

Étalement-Séchage Coupes de 3µ sur ► bain d’eau distillée à 37 - 40°C, décontaminé le soir !!!! ou ► Sur plaques chauffantes progressives +++ Lames spéciales (+système adhésif) Drainer sur champ à température ambiante Sécher 1 h à 58° puis une nuit à 37°+++ dans l’étuve ventilée ( thermomètre de contrôle à l’intérieur) Pl@nète Roche Cancéro -66 -

Microtome dédié et piscine thermostatée et lumineuse Pl@nète Roche Cancéro -67 -

Déparaffinage ++++ Séquence automatisée: Toluène 3 x (5 minutes) 15 min Ethanol 100%, 95%, 80% 6 min. Eau déminéralisée 2 min. RENOUVELLEMENT DES BAINS REGULIEREMENT • un bain par jour !! Pl@nète Roche Cancéro -68 -

Démasquage au micro-ondes ie r a m n i a b u o ien r n o in S ! !. !! . … s ro u e 00 • 70 Pl@nète Roche Cancéro -69 -

Les cuves du four micro-ondes Pl@nète Roche Cancéro -70 -

Démasquage au bain-marie 40 minutes à 97°C (thermomètre !!) Puis 20 minutes précises dans le tampon sur la paillasse Pl@nète Roche Cancéro -71 -

Tampon citrate à faire soi même ou tout prêt (chez DAKO par ex) Acide citrique 1 m. M (solution A) Tris sodium citrate 1 m. M (solution B) 14 ml de A + 86 ml de B + eau distillée qsp 1000 ml = solution de travail Le p. H est ajusté à 6. 10 +++ par addition de HCl ou Na. OH Pl@nète Roche Cancéro -72 -

Le p. H mètre un investissement indispensable Pl@nète Roche Cancéro -73 -

Anticorps utilisés Polyclonal : grande sensibilité A 485 Monoclonal : grande spécificité CB 11, SP 3 (lapin), Ventana (clone 4 B 5) Reconnaissant un des domaines externe ou interne de HER 2 Pl@nète Roche Cancéro -74 -

Pipetage • Apprendre à pipeter juste avec des Pipettes contrôlées. Précision, fidélité et justesse!! • Maintenance tous les ans (joints d’étanchéité) • Au labo : tous les 2 mois par pesées – 1000µl = 1 gr et 500µl= 0, 5 g, (trois mesures ) – Cônes stériles+++ – Précision du pipetage : contrôle visuel lors du pipetage Pl@nète Roche Cancéro -75 -

Dilution La plus élevée possible - pas de marquage des glandes normales Détecter uniquement la surexpression (glandes normales négatives) Étalonnée par rapport à la FISH +++++ Les dilutions sont ajustées en fonction du lot d’anticorps. (annexes exemples FPL ) Pl@nète Roche Cancéro -76 -

Prévention des contaminations Utilisation de gants et de matériel à usage unique Utilisation de diluant pour anticorps du commerce (surfactant et bactéricide) Pl@nète Roche Cancéro -77 -

« Aliquotage » Limiter la fréquence des pipetages Les dilutions d’anticorps primaires sont réalisées à distance de la manipulation par un technicien responsable. Chaque lot d’anticorps dilué fait le l’objet d’une vérification du titre Garder la feuille de l’ANTICORPS (n° du LOT à noter sur le flacon ainsi que la date d’ouverture) Préparer les aliquots par ex CB 11 NOVOCASTRA : un tube stock aliquoté ajusté en fonction de la dilution que l’on utilise et de la consommation du laboratoire. L’anticorps dilué se conserve moins bien (moins d’ 1 semaine) Les aliquots sont conservés congelés à -20°C 100µl minimum sinon risque de dessication (>6 MOIS) Pl@nète Roche Cancéro -78 -

Tous les réactifs (PBT, PBS…), sont préparés stérilement en dose unique En dehors des produits prêts à l’emploi des automates type Benchmarck, Ventana… Pl@nète Roche Cancéro -79 -

Kits de révélation AC-BIOTINE<>AVIDINE (exemple: ABC de VECTOR, Ventana) Polymères (de dextran; exemple : Envision…) Pl@nète Roche Cancéro -80 -

Regroupement des demandes Pour l’analyse en série (minimum de 10 cas à la fois) Regroupement des techniques HER 2 pour des structures avec recrutement plus faible Optimisation du temps technique et préparation des réactifs Introduction de lames témoins externes à chaque manipulation DATER les lames d’une même manip (lot de lames techniquées) Pl@nète Roche Cancéro -81 -

Automatisation de la séquence Autostainer Benchmark Bond max etc. . . Pl@nète Roche Cancéro -82 -

Avantage de l’automatisation Standardisation Pas de consommable spécifique Ouverture à tout les système détection Intervention possible du technicien en cas de problème Grande capacité Pl@nète Roche Cancéro -83 -

Lames témoins Des coupes multi-tissulaires issues de blocs dont le statut du gène HER 2 est connu (FISH) Sinon accessibilité de la FISH (à recher auprès des centres de référence ++++) Prendre au minimum des glandes normales et une maladie de PAGET ou un Carcinome in situ de haut grade HER 2 +++) Elles sont utilisées dans chaque série analysée Lames datées à chaque manipulation et conservées au laboratoire, accessibles à tous Ne pas couper les lames trop longtemps avant la manipulation (idéalement une semaine avant), à conserver à +4°C à l’abri de la poussière Pl@nète Roche Cancéro -84 -

Choix des zones d’intérêt Pl@nète Roche Cancéro -85 -

Forage des blocs donneurs Pl@nète Roche Cancéro -86 -

Confection du bloc multi-tissulaire témoins externes Pl@nète Roche Cancéro -87 -

Utilisation de témoins Témoin négatif Glandes normales Pl@nète Roche Cancéro Témoin positif de réaction Maladie de PAGET -88 -

Critères d’interprétation des cas positifs Expression forte Score : 3+ Marquage complet et intense Fort niveau d’amplification > 15 copies du gène Expression modérée Score : 2+ Vérification du statut du gène/FISH Faible niveau d’amplification 8 – 10 copies du gène Pl@nète Roche Cancéro -89 -

Feuille de paillasse Un exemple Pl@nète Roche Cancéro -90 -

Commentaires de manipulation et de validation Pl@nète Roche Cancéro -91 -

Dialogue médecins & techniciens TRAVAIL MAIN DANS LA MAIN Feuilles de manip, commentaires de validation des témoins Pl@nète Roche Cancéro -92 -

remerciements À l’équipe qui l’a réalisé Anne Vincent Salomon Institut Curie Paris André Nicolas Institut Curie Paris Jérôme Couturier Institut Curie Paris Matthieu Roche Centre Jean Perrin Clermont Ferrand Et à ceux qui ont bien voulu le relire Laurent Arnould Centre Georges François Leclerc Dijon Jean-Marc Guinebretière Centre René Hugenin St Cloud Jocelyne Jacquemier Centre Paoli Calmettes Marseille Frédérique Penault Llorca Centre Jean Perrin Clermont Ferrand Magali Lacroix Centre Claudius Regaud Toulouse Gaetan Mac Grogan, Institut Bergonié Bordeaux Pl@nète Roche Cancéro -93 -

Le statut HER 2 ne serait pas stable et pourrait être acquis au cours de l’évolution tumorale Meng S PNAS 2004 Pl@nète Roche Cancéro -94 -

Meng S, PNAS 2004 33 patientes stade I à IV Comparaison de l’amplification HER 2 dans les cellules tumorales circulantes et dans la tumeur primitive Puis même étude sur 24 patientes HER 2 - Pl@nète Roche Cancéro -95 -

Etude initiale sur 33 patientes Le statut HER 2 est concordant pour 29 patientes (11 +/+et 18 -/-). Il est discordant pour 4 patientes présentant un statut HER 2 tumoral positif (par FISH) et négatif sur les CTC ; pour 3 de ces patientes, un traitement par chimiothérapie et/ou anti HER 2 avait été instauré; faussant probablement les résultats, par la destruction des CTC HER 2 positives. Pl@nète Roche Cancéro -96 -

24 HER 2 - Ils ont alors évalué le statut HER 2 sur CTC chez 24 patientes initialement HER 2 « négatives » en rechute. Parmi ces 24 patientes, 9 ont acquis un statut HER 2 « positif » lors de la progression Les 9 patientes ont alors reçu un traitement anti HER 2: 2 RP et une RC Pl@nète Roche Cancéro -97 -

Critiques de l’étude Les niveaux d’amplification (rapport HER 2/chromosome 17) sont deux à trois fois plus élevés dans la tumeur initiale par rapport aux CTC. Ceci est assez troublant car l’amplification génique est un phénomène stable. Il est difficile de comprendre pourquoi les cellules métastatiques comme les CTC présentent des taux d’amplification plus faibles que ceux de la tumeur initiale. Par ailleurs, pour les CTC qui acquièrent une amplification (tumeur initiale négative), les taux sont également faibles (de l’ordre de 2. 2 soit inférieur à la valeur limite reconnue pour une amplification). Pl@nète Roche Cancéro -98 -

Pourquoi les CTC présentent elles des niveaux d’amplification si bas ? Plusieurs hypothèses se discutent : – soit le statut HER 2 n’a pas été correctement évalué dans la tumeur initiale (problème technique, problème de fixation tissulaire) – soit la CTC présente surtout une hyperploïdie du chromosome 17 entraînant essentiellement une sur représentation de HER 2, ce qui expliquerait ces valeurs limites d’amplification ; – soit la cellule métastatique acquiert vraiment une amplification de HER 2, par sélection d’un clone HER 2+ lors des nombreux traitements reçus par ces patientes pour certaines en phase terminale Pl@nète Roche Cancéro -99 -

Si ces résultats sont confirmés, il faudra peut être re-tester les patientes négatives sur la tumeur initiale au niveau des métastases Pl@nète Roche Cancéro -100 -