C A U ChristianAlbrechtsUniversitt zu Kiel Entwicklung stammspezifischer

C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

Entwicklung stammspezifischer PCRSysteme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien Von Christian Stelter

Überblick 1. „Subtraktive Hybridisierung“ 2. Ziel der Methode? 3. Welche Vorteile? 2. Prinzipieller Ablauf der Methode 3. Praktische Ergebnisse 4. Ausblick

Entwicklung „Subtractive Hybridization“ als Basis, um • genetische Unterschiede zu identifizieren. Identifizierung von Genaktivität für • Embryonalentwicklung • Krebsentstehung Identifizieren von Unterschieden im Genom • verschiedener Stämme von Bakterien • komplexer eukaryotischer Lebewesen

Biotechnologie in menschlichen Kulturen • unkontrollierte Fermentation • 6000 v. Chr. Alkoholische Getränke im Zweistromland Milchwirtschaft durch Nomaden in Zentralasien Ziel: Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln

Notwendigkeit zur Diagnose • genetische Identität • Stabilität von Starterkulturen • hygienische Risiken • wirtschaftliche Effizienz routinemäßige Verifikation durch genetische Fingerabdrücke

Notwendigkeit zur Diagnose • Fingerprinting

Notwendigkeit zur Diagnose • Verständnis probiotischer Eigenschaften

Anwendbarkeit der SSH Genomische Unterschiede identifizieren/isolieren Um darauf aufbauend a) Funktion der unterschiedlichen DNA zu analysieren b) PCR-basierende Nachweissysteme zu erstellen c) Eigenschaften in weiteren MOs zu detektieren

Subtraktive Hybridisierung dominante Quelle der genomischen Variation: Insertionen oder Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen

Subtraktive Hybridisierung gezielte Identifikation von Unterschieden besonders vorteilhaft

Subtraktive Hybridisierung

Subtraktive Hybridisierung Ausgangsmaterial

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Fragmentieren

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Mischen

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Denaturieren

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Hybridisieren

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Isolieren

wichtige Entwicklungsschritte Entwicklungen innerhalb der „Subtraktiven Hybridisierung“ betrafen die Isolierung der stammspezifischen, einzelsträngigen DNA a) Immobilisierung b) Suppression Effekt

Isolierung durch Immobilisierung Immobilisierte Subtraktor-DNA

Isolierung durch Immobilisierung Zugegebene, denaturierte Proben-DNA

Isolierung durch Immobilisierung Homologe DNA-Fragmente werden dem Überstand entzogen

Suppression Subtractive Hybridization Verwendung von Adaptoren Vorteile: 1) Geringste Mengen 2) Suppression Effekt

Suppression Effekt

Vorteile der SH/SSH • Geringe Materialanforderungen (PCR) • bis zu 96% der Unterschiede identifizierbar • Verzicht auf die Sequenzierung vollständiger Genome • Reduktion des zeitlichen und finanziellen Aufwandes

Bisherige Anwendung Genomanalysen im medizinischen Bereich: • Identifikation von Virulenzgenen • neuartigen Restriktions-Modifikationssystemen • Antibiotikaresistenzen • Oberflächenstrukturen • PAIs: „pathogenicity islands“

Praktische Ergebnisse Anwendung auf Milchsäurebakterien Lactococcus St. 1760 -1526 Lactococcus St. 1526 -1760 • Isolierung der unterschiedlichen Regionen: • Funktionen der unterschiedlichen Regionen • Stammspezifische PCR-Systeme • Suche nach Eigenschaften in anderen MOs

Anreicherung stammspezifischer Fragmente 1526 – 1760 = ? 1760 – 1526 = ?

Gefundene Unterschiede Lactococcus Stamm 1760 • A 2: Bacteriocin-Produktion • A 5: Funktion unbekannt Lactococcus Stamm 1526 • A 22: zellwandassoziierte Proteinase • A 23: Restriktionsmodifikationssystem [subunit (hsd. S) gene]

PCR-Systeme auf die verwendeten Stämme Proteinase Nisin hsd. S ? 1526 1760 A 2: Nisin A 5: ? A 22: Proteinase A 23: hsd. S

PCR-Systeme auf weitere Stämme 89 bp: ? 166 bp: Proteinase 271 bp: hsd. S 322 bp: Nisin

Weitergehende Anwendungen Identifizieren von probiotischen Eigenschaften • größere Überlebensrate • dauerhafte Ansiedlung • Reduktion von mutagenen Enzymen • Stimulation von Makrophagen Identifikation von gentechnisch veränderten Organismen ehemalige Systementwicklung: Reaktionen auf Stress

Danisco Cultor Niebüll Gmb. H Dr. Udo Friedrich PD Dr. Winfried Hausner Danke

Wir haben einen Überschuss an einfachen Fragen und einen Mangel an einfachen Antworten. Lothar Schmidt Noch Fragen?

Gott weiß alles, sagt es aber nicht. Ich weiß nichts und sage alles. unbekannt Immer noch Fragen?

Suppression Subtractive Hybridization