BYOLOJK AZOT FKSASYONUNDA RHIZOBIUM VE BAKLAGL SMBYOSS HAKKINDA

BİYOLOJİK AZOT FİKSASYONUNDA RHIZOBIUM VE BAKLAGİL SİMBİYOSİS’İ HAKKINDA GENEL BİLGİ

• Simbiyotik ilişkideki karşılıklı yarar, özellikle baklagiller familyasından bitkilerle, Rhizobium türündeki bakteriler arasında görülür. Bu ilişki bitkilerin kökündeki nodül adını alan organ formunda kendini gösterir. • Nodüller, atmosferik azot fiksasyonun bitkilerde gerçekleştiği ve gözle görülebilen irilikreki yuvarlak, çoğu kez beyaz renkte, ancak iç kısımları laechehaoemoglobinden dolayı pembe renkli olan, bitkiye has Rhizobium’ların ancak mikroskopla görülebildiği botanik yapılardır.

Baklagiller azotu iki şekilde alırlar; �Topraktan azot asimilasyonuyla; Bu olay yani nitrat absorpsiyonu (organik madde kaynaklı ya da gübre) doğrudan köklerden gerçekleşir. Nitratlar amonyak üretimi için özellikle yapraklarda yer alan nitrat redüktaz enzimi tarafından indirgenir. Amonyak yapıya aminoasit ve protein formunda katılır. Bu enzim bütün baklagillerde bulunur. �Atmosferik azot fiksasyonuyla; Topraktaki atmosferik azot Rhizobium bakterilerindeki nitrogenaz enzimi ile amonyağa indirgenir, ardından aminoasit ve protein üretmek için karbon iskeletinde birleştirilir. Sadece azot fiksasyon nodülü olan baklagiller bu enzime sahiptir. Aktif olan nodüllerin merkezi kırmızıdır.

• Bu mekanizmaların her ikisi de baklagillerde vardır. Toprak azotu ile kullanılan gübre miktarının ekonomik olabilmesi için azot fiksasyonu ve asimilasyonu oranlarını arttırmaya çalışılmalıdır. • Azot, ne yazık ki, toprakta N 2 ve NO 3 olmak üzere iki şekilde bulunduğu için bitki; NO 3 formundaki azotu yeğlemekte ve bunun sonucunda da yaptığı azot fiksasyonu, dolayısıyla da verim düzeyleri düşmektedir. Bundan dolayı da Fasulye ve yerfıstığı gibi bazı bitkilerde ayrıca N’ li gübreleme yapılırsa ya da yapıldığında ürün miktarı, verim düzeyi, artmaktadır.

NODÜL OLUŞUMU

�Rhizobium bakterileri sıklıkla toprakta bulunurlar ve tohumun çimlenmesiyle, bitkinin rhizosferinde çoğalmaya başlarlar. Erken safhada, hala tam olarak anlaşılamamış bir mekanizmayla (bakteriler) bitki köklerine giriş yaparlar. �Bu işlem, Yonca’da olduğu gibi bitkinin kök saçaklarına tutunmak ya da Yerfıstığı’nda olduğu gibi bitkinin yan köklerindeki açıklıklardan giriş şeklinde olabilir. �Mikroskobik çalışmalar, bakterilerin, köklere kök korteks hücrelerinden giriş yaptıklarını, burada dallanarak geliştiklerini ve böylece nodül taslağını oluşturduklarını göstermiştir.

Konukçu bitki hücreleri rhizobium infeksiyonu nedeniyle çoğalmaya başlarlar. Yan hücrelerde çoğalarak sonuçta beş kısımdan oluşan nodül meydana gelir. Bunlar: • Nodülün gelişimini sağlayan meristem hücreleri = Bu hücrelere rhizobium bulaşmamıştır. • İnfeksiyon merkezi : Bu bölgedeki hücreler aktif olarak çoğalırlar. Rhizobium tarafından kirletilmemişlerdir ancak burada fiksasyon gerçekleşmez. • Fiksasyon merkezi : Konukçu bitki hücrelerinin şişkin ve pleomorfik şekillere neden olan rhizobia bakteroidleri tarafından işgal edilmiş kısmıdır.

Bu formda rhizobium atmosfer azotunun fiske edilmesini sağlayan nitrogenaz enzimini içerir. Bu enzim demir ve molibden elementlerini ihtiva eder. Bu metaller elektron iletiminde gereklidir. Bu bölge lachehemoglobin nedeniyle kırmızıdır. Lachehemoglobin bakterilere oksijen taşınmasında görev alan bir pigmenttir. Dejenerasyon bölgesi : Bu bölge kahverengi yada yeşildir. Konukçu bitki hücrelerinin dejenere olduğu bölgedir. Burada fiksasyon gerçekleşmez. Vasküler sistem : Bitkiden nodüllere fiksasyon reaksiyonu için gerekli olan karbonhidrat ve su iletimini sağlar. Nodüllerden de kullanılabilir forma dönüştürülmüş azotlu bileşiklerin yapraklara iletimini sağlar.

Farklı Şekil ve Ebatlardaki Nodüller �Nodüller genellikle köklerde bulunurlar (Pisum, Glycine, Stylosanthes, Cajanus). Bazı bitkilerin kök yüzeyinde bulunan nodüller, bitkiden kolayca ayrılabilirlerken, bazıları köklere sıkıca yapışmış halde bulunurlar (Arachis, aeschynomene). Bazı türlerde nodül oluşumu saplarda görülür (Sesbonia, Rostrata, Aeschynomene). Apikal meristemi olan nodüller, gerilip uzamış görünümündedirler ( Medicago, Pisum). Öte yandan, meristemle sarılı olan bazı çeşitlerde nodüller yaygın durumdadırlar (Vigna, Glycine vb…). Pek çok değişik şekil ve boyutlarda nodüle rastlanılabilir. Beyaz yoncanın ve Stylosanthes’in nodül çapları 1 mm den daha azdır. Bu nedenle aktif olan nodüllerin karakterlerini ayırt etmek oldukça zordur. Soya fasulyesi ile Vigna nodüllerinin çapları ise 2 -3 cm ye kadar çıkar.

• Yukarıda toprağın hava alan kısımlarındaki nodül oluşumları görülmektedir. Taşkınlar ve sel baskınları fiksasyonu durdurur ve dejenerasyona neden olur. Bununla birlikte sel baskınlarına uğramış, nemli topraklara uyum sağlayabilen bazı türlerde vardır.

Simbiyotik azot fiksasyonu; yüksek bitkiler ile bunlara has bakteri türleri arasındaki dengeli bir ilişkinin sonucudur. Bu mekanizmayı anlamaya çalışmak; hem bitkide optimum yararı sağlamak ve hem de fiksasyon olayının gerçekleşmesindeki optimum koşulları sağlamak açısından oldukça önemlidir. Bunun için; �Uygun toprak koşulları sağlanmalı (havalanmış toprak), �Molibden ve bor mineralleri yeteri miktarda olmalı, �Toprakta az miktarda azotlu bileşikler bulunmalı, �Bitkiye uygun Rhizobium bakterisi bulunmalı, �Bitki gelişimine uygun koşullar sağlanmalıdır (iklim, uygun kültürel işlemler, uyu yapmış türler, hastalık ve zararlılardan korunma gibi).

• Özetle; Atmosferik azot fiksasyonunu arttırmak için baklagil gelişimini sınırlayan ilgili faktörlerin ortadan kaldırılması gerekmektedir.

BAKLAGİL NODÜLLERİNDEKİ NİTROGENAZ AKTİVİTESİNİ DEĞERLENDİRMEK İÇİN AKTİVİTEYİ AZALTICI ASETİLEN KULLANIMI

ÇALIŞMA PRENSİPLERİ �Nitrogenaz; in vitro koşullarda aşağıdaki biyolojik azot indirgeme reaksiyonunu katalize eden bir enzimdir. �N 2 + 8 H + 8 e- → 2 NH 3 + H 2 (2) �Bu enzim diğerlerinden farklı olarak N 2 ve H+ yı bağlama özelliğine sahiptir. Bu durum, asetileni etilene indirgeyen üçlü bağ ile karakterize edilir. �C 2 H 2 + 2 H+ + 2 e- → C 2 H 4 (2) �Azot fiksasyonu gerçekleştiren organlar, ortalama %10 C 2 H 2 içeren atmosferik bir ortamda kuluçkaya alındığında asetilen nitrogenaz dışındaki maddelerin önlenmesini sağlar.

• Bu koşullarda kullanılan etilenin miktarı ve veriliş zamanı nitrogenaz enzimi tarafından gerçekleştirilen toplam elektron transferine benzer. Bu açıdan indirgenmiş asetilen miktarı nitrogenaz enziminin indirgeme aktivitesinin bir ölçütüdür. • Bu değerlendirme metodu ARA ismiyle anılır (= asetilen indirgeme aktivitesi). Yine de bu metodun nitrogenaz tarafından indirgenmiş azot miktarının belirlenmesinde kesin sonuç verdiğini söylemek olanaksızdır.

�Esasen, havada % 70 oranında N 2 ve % 20 oranında bulunan O 2 sadece aktif olarak atmosferik azota çevrilen elektron fraksiyonlarıdır. Diğer fraksiyonlar ise proton indirgeme reaksiyonları için gereklidir. Bu verilere ek olarak başka bir çok fraksiyon vardır. Öyle ki, bazı organizmalar hidrojen dönüşümünü sağlayan hidrogenaz enzimini içerirler. Öte yandan, nitrogenazın C 2 H 2 ‘ yi indirgemesi için gereken enerji miktarı N 2 yi indirgemesi için gerekli olmayacaktır. �Bazı olumsuz özelliklerine karşın, asetilen indirgeme metodu; kullanımının kolay olması ve nitrogenaz enzimi aktivitesinin hemen durdurulmasını sağladığı için Rhizobiyoloji’de geniş bir kullanım alanına sahiptir; böylelikle de her ne kadar kimi olumsuz etkileri olsa da ölçüm yapılırken, yeğlenen bir yöntemdir.

METOD VE MATERYAL �Kesilmiş bitki organları cam ya da plastik silindir beherde kuluçkaya alınır (burada doğrudan nodüller kesilip, alınmaz. Nodül oluşumları kökle birlikte kesilip, alınır). �Üstüne konulacak asetilenin için, hacmi inkübatöre enjekte edilmiş (konulmuş) materyal hacminin % 10 una ayarlanır. C 2 H 2 ‘ nin eldesi için gereken kalsiyum bileşikleri ya dolaylı olarak (Ca. C 2 + 2 H 2 O → Ca(OH)2 + 2 C 2 H 2) ya da doğrudan basınçlı gaz silindirlerinden sağlanır.

�Kuluçka işlemi için kullanılan gaz hacmini belirlemek için reaksiyonu etkilemeyen izleyici bir gaz kullanılır (örneğin Propan). �Asetileni enjekte ettikten hemen sonra kuluçkadaki gaz karışımından küçük bir örnek alınır. Buna ilk ölçüm denir.

Buna ilk ölçüm denir. Daha sonra belli aralıklarla ( örneğin her 10 dk da bir, beherde kuluçka yapılıyorsa yarım saatte bir ) aşağıdaki işlemlerle gaz karışımından örnek alınır; � 10 ml hacmindeki bir pilastik enjektör, lastik tıkaçtan geçirilir, �İçerideki gaz karışımını, homojen bir hale getirmek için yine plastik enjektör ile 3 kez hava çekilir ve şişeye geri bırakılır, �Daha sonra bu plastik enjektörle 5 ml’ lik gaz örneği alınır. Alınan bu örnek, derhal içinden 10 ml havanın çekildiği ve 13 ml hacmindeki venoject örnek tüpüne aktarılır.

� 10 ml lik havanın çekilmesi işleminin amacı depolamada fazla basıncın önlenmesidir. Etilen ve asetilen ile yapılan (Propanda kullanılabilir) bu analiz, iyonizasyon alev dedektörlü gaz kromotografında uygulanır (42 o poraka R sütun, 1. 8 mm uzunluk, 3. 2 mm çap ile 36 ml/da N 2 gaz akışı sağlar). �Venoject örnek tüpündeki 0. 5 ml içeriğe; 3 kez havayla dikkatlice temizlenmiş, 1 ml’lik plastik enjektörle kromotograf’a enjekte edilip; etilen miktarının maksimum olduğu nokta okunarak; enjekte edilen 0. 5 ml’ lik gaz karışımındaki etilen miktarının mol’ü hesaplanır ve olması gereken miktarlarla karşılaştırılır. Daha sonra venoject örnek tüpündeki karışımda olan diğer gazlarda aynı yöntemlerle hesaplanır.

METODİK SORUNLAR • Birçok faktör nitrogenaz aktivitesini doğrudan etkiler. • CO 2 miktarı % 1’ in üstüne çıkarsa, solunum engellenir ve nodüllerdeki nitrogenaz aktivitesi düşer. • Oksijen basıncının düşmesiyle, yüksek solunum ihtiyacı oluşur; bu durum ise nodüllerdeki nitrogenaz aktivitesinde önemli düşüşlere neden olur. • Sıcaklıktaki değişiklikler nodül aktivitesinde ani düşüşlere neden olur.

�Nodüller; konukçu bitki fotosenteziyle nitrogenaz redüksiyonu için gerekli enerjiyi sağlarlar. Fotosentetik bir aktivitedeki modifikasyon asetilen indirgeme aktivitesindeki bir varyasyona öncülük eder. �Küçük şişe adı verilen metod, nitrogenaz aktivitesinin 50 dk altına düştüğü kısa periyotlarda kullanılır. Bu metod, ARA’ ya göre daha çok kullanılır ancak ARA bu yönteme göre daha sabit sonuçlar verir. �Nodül aktivitesinin hesaplanmasında kullanılan bu yöntem; doğal ortamda uygulandığında kullanılan silindirik kap, ısıtılmalı fotosentez ve nitrogenaz aktivitesinde etkili olan CO 2 miktarı ayarlanmalıdır. Ortam koşullarının belli oranlarda ayarlanabilir olması nedeniyle bazı durumlarda, dal kesitlerindeki nodül inceleme sırasında kullanılan tablalar yerine silindirik kaplar tercih edilir.

BAZI BAKLAGİL NODÜLLERİNDEKİ HİDROJEN DÖNGÜSÜ �Bazı baklagil-nodül kombinasyonları, serbest hidrojen oluşturmazlar (RE=1). Buna bakteroidin membranında yer alan bir hidrogenaz neden olur. Bu hidrogenaz oksidihidrogenaz reaksiyonu sırasında görülen hidrojen molekülünün döngüsünü sağlar. �H 2 + 1/2 O 2 → H 2 O �Bu reaksiyonda iki ATP molekülü oluşturulacaktır. Bu şu anlama gelir; �Verimlilik döngüsündeki H 2 ‘ nin tamamı oluşturulduğunda H 2‘ nin nitrogenaz sentezi için bu enerjinin % 50 si kullanılır. Hidrogenaz sistemine sahip olan Rhizobium türleri Hup+ türleri olarak adlandırılır.