BTKLERE GEN TRANSFERNDE KULLANILAN DORUDAN YNTEMLER ERK Mikroenjeksiyon

BİTKİLERE GEN TRANSFERİNDE KULLANILAN DOĞRUDAN YÖNTEMLER

İÇERİK • Mikroenjeksiyon • Makroenjeksiyon • Kimyasal Yöntemlerle Gen Transferi • Lipozomlarla Gen Transferi • Elektroforez • Mikrolazer • Polen Tüpü Yolu İle Gen Transferi • Zigotik Embriyoya DNA Emdirilmesi • Silikon Karbid Fiberler Aracılı DNA Transferi • Sonikasyon • Desikasyon Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 2

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ • En kesin biçimde hücrenin istenilen bölmesine DNA’nın enjeksiyonu • Mikroenjeksiyon, mikroskop altında, kapiller mikropipet aracılığıyla nükleus veya sitoplazma içerisine DNA’nın aktarımı • Hedef; protoplastlar, izole edilmiş hücreler, kallus, meristemler, zigotik mikrospor türevli proembriyolar gibi çok hücreli dokular ve 3

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Aktarım sırasında hücreler sabitlenmelidir: • Vakum yoluyla hücreleri tutan tutucu pipetin kullanımı • Hücrelerin poli-L-lisin kaplı cama bağlanması • Hücreleri agaroz, agar veya sodyum alginat içine koymak • Bu çözümlerin hiçbirinin kullanışlılığı kanıtlanmamıştır (Poli-L-lisin bazı türler için toksik olabilir. Toksisiteden sakınmak için agaroza konulabilir ama agoroz çok ince bir tabaka olsa bile manüplasyon alanında görünebilirliği azaltır). 4

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Bu işlem, mikromanipulatör gerektirir: • DNA mikromanipülatör sistemine bağlı kapiller mikropipet aracılığıyla doğrudan hücrenin çekirdeğine aktarılır (Mikropipet aracılığıyla genetik materyali içeren sıvının çıkışı için hidrostatik basınç kullanılır). • Mikropipetin hareketi mikroskopla görsel olarak kontrol edilir.

MİKROMANİPÜLATÖR SİSTEM ŞEMASI: (1) Inverted mikroskop (2) Su basınçlı mikromanipülatör kumandası (3) Mikroenjektör (4) Hareketli masa (5) Uzaktan kontrollü, su basınçlı mikrosürücü (6) Yardımcı hafif ağırlıklı manipülatör (7) Mikroiğne tutucu (8) Video kamera için yaklaştırıcı mercek 6

MİKROMANİPÜLATÖR 7

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ 8

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ • Bu yöntem ilk olarak 1980 yılında başarılı bir şekilde uygulandı. Capecchi, kültüre edilmiş memeli hücrelerinin hem sitoplazma hem de nükleusu içerisine DNA’yı mikroenjekte etti. DNA’nın doğrudan nukleus içine mikroenjeksiyonu, sitoplazma içi enjeksiyondan daha yüksek seviyede gen ekspresyonuyla sonuçlandı. • 1980 yılında, Gordon ve ark, transgenik fare üretmek için plazmid DNA’sını döllenmiş fare oositlerinin pronükleusu içerisine mikroenjekte etti. 9

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ • Mikroenjeksiyon çoğunlukla kullanılır. Bu yöntemi bitki uygulamaktan daha zordur: hayvan hücrelerinin transformasyonunda hücrelerine uygulamak hayvan hücrelerine 10

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ • Bitki hücreleri hücre duvarı içerir (Kalın tabaka lignin ve selüloz içermesi nedeniyle mikroiğnelerle aktarımı zorlaştırır). Protoplastın (enzimatik veya mekanik yollarla hücre duvarı uzaklaştırılmış bitki hücresi) mikroenjeksiyonu teorik olarak bu kısıtlandırmayı ortadan kaldırır. 11

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ • Bununla birlikte vakuol birçok hidrolaz ve toksik bileşik içermesi nedeniyle vakuolden sitoplazmaya hidrolazlar ve diğer toksik bileşenlerin ayrılması protoplastın hızlı ölümüne neden olabililir. Mikroenjeksiyondan önce protoplast yaşayabilirliği için hiçbir önemi olmayan vakuolleri uzaklaştırmak mümkün olmasına karşın, onların kaybı bitkinin bölünme ve rejenerasyon yeteneğini anlamlı derecede azaltır. 12

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ • 1986 yılında Crossway ve ark. tarafından tütün protoplastlarında sitoplazmik aktarıma karşı nükleus içine aktarımın etkinliği incelendi. Nuklear mikroenjeksiyonda entegrasyon sıklığı %14, sitoplazmik mikroenjeksiyonda %6 bulundu. 13

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ • Bitki hücrelerinin hücresel fonksiyonlarının ve plastid fizyolojisinin çalışılması için güçlü bir araç olmuştur. 14

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ GFP kodlayan DNA’nın soğan hücresi içerisine aktarımı. Enjeksiyondan 2 gün sonra yeşil boya görülebilir. Yabancı DNA’nın soğan genomu içerisine başarılı şekilde aktarımı Patates kallus hücresi içerisine mikroenjeksiyon 15

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Tütün yaprak kloroplastına GFP’nin mikroenjeksiyonu 16

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ OLUMLU YÖNLERİ • DNA’nın bitki hücresi içerisine doğrudan ve kesin olanağı) • DNA miktarı kontrol edilebilir • Genellikle, yüksek transformasyon etkinliği (%14 -66) (Enjeksiyonun gerçekleştirildiği tüm hücreler DNA içerir, bununla birlikte transforme olan hücrelerin sayısı sınırlıdır. ) • • • İşaret genleri yoluyla transformantların seçimindan kaçınılır aktarımı (Görsel kontrol Çeşitli hücre ve dokularda kullanılabilir 17

MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ OLUMSUZ YÖNLERİ • Kavramsal olarak, mikroinjeksiyon en basit gen aktarım yöntemi olmakla birlikte uygulaması zordur. • Yöntem çok yavaş - Tek seferde tek bir hücreye aktarım • Zahmetli - Çalışan kişinin el becerisini ve deneyimini gerektirir. • Pahalı mikromanipulatör gerektirir • Tek bir hücreden bitkinin rejenerasyonu https: //www. youtube. com/watch? v=pu. Pu. FAa. Xy. U 0 18

MAKROENJEKSİYON • Aktarılmak istenen DNA’yı taşıyan plazmid solüsyonunun fideciklere enjeksiyonu ile gen aktarımı • 1987 yılında Pena ve ark. çavdarın (Secale cereale) olgunlaşmamış çiçek meristeminin altındaki gövde bölgesine npt. II işaret geni enjekte edilmiştir ve enjeksiyon yapılmış bitkiden elde edilen tohumlar kanamisine direnç bakımından seçilmişlerdir. • Bu yöntem, diğer tahıllarda başarılı olarak uygulanamamıştır. 19

KİMYASAL YÖNTEMLERLE GEN TRANSFERİ • En geniş çapta kullanılan kimyasal Polietilen glikol (PEG)’dür. • PEG iyonik olmayan ve suda çözünebilen bir polimerdir. • PEG gibi kimyasal maddeler protoplastların plazma membranının geçirgenliğini geri dönüşümlü olarak arttırabilir. Bu sayede, DNA’nın nukleus içine girmesi ve genom içerisine entegre olması gerçekleşir. (PEG ayrıca, lipozom alınımını teşvik eder ve elektroporasyonun artırır. ) etkinliğini 20

KİMYASAL YÖNTEMLERLE GEN TRANSFERİ PEG aracılı transformasyon; • İzole edilen protoplastlar aktarılmak istenen DNA ile karıştırılır ve ardından divalent katyon içeren bir tamponda çözünmüş olan %14 -20 PEG eklenir ve daha sonra bu karışım inkübe edilir (Protoplastlar divalent katyonların yokluğunda kararsızdırlar). Protoplastlar yıkanır ve daha sonra kültürleme için petri kaplarına aktarılır. • (Birçok çalışmada, PEG aracılı transformasyonda Ca+2 ve Mg+2 etkinlikleri karşılaştırmış, Mg+2 daha üstün bulunmuştur. ) 21

KİMYASAL YÖNTEMLERLE GEN TRANSFERİ • Önemli parametreler: • Karışımdaki PEG konsantrasyonu • Kullanılan tuzların bileşimi ve konsantrasyonu • Solüsyonun p. H’sı • Yabancı DNA’nın konsantrasyonu • Kullanılan DNA molekülünün formu ve boyutu • Bitki türü • Kültürleme koşulları 22

KİMYASAL YÖNTEMLERLE GEN TRANSFERİ OLUMLU YÖNLERİ: • • Basit bir yöntem Birçok örneğe eşzamanlı uygulama Ucuz (Pahalı olmayan ekipman) Geniş çapta bitki türlerine kolayca uygulanabilir OLUMSUZ YÖNLERİ: • Protoplastların kullanımını gerektirdiği için elverişsizdir (Protoplastların yaşayabilirliği düşük) • Düşük transformasyon etkinliği (%1 -2) • Rejenerasyon güçlüğü 23

LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ • Lipozomlar; yapay olarak üretilen çift tabakalı fosfolipid kürecikleri • 1960’lı yıllarda keşfedildi. • Fosfolipid molekülleri sulu ortamda kendiliğinden lipozomları oluşturur. 24

LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ • Lipozomların farklı materyalleri kapsüle etme yetenekleri ve lipozom teknolojisindeki gelişmeler, aktif ajanların hücre içerisine alınımında lipozomların kullanılmasında bir artışa yol açmıştır (antikanser ilaçları, aşı adjuvanı, antienfektif ajanlar; gen aktarımı) (Lipozomların hücrelerle füzyonu PEG gibi kimyasallarla teşvik edilir ) 25

LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ 26

LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ DNA taşıyan lipozomların bitki protoplastlarının hücre zarı ile füzyonu sonucu bitkilere gen aktarımı gerçekleşebilmektedir. Lipozomların hücre zarı ile füzyonu ve endositoz sayesinde DNA molekülünün hücre içine alınımı gerçekleşir. Lipozom aracılı transformasyon, transformasyon karşımında katyonlar gibi pozitif yüklü ajanlar veya katyonik lipozom preparatları kullanılarak gerçekleştirilir. 27

LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ OLUMLU YÖNLERİ: • DNA’nın lipozomlar tarafından korunması nedeniyle büyük boyutlu plazmidlerin (19 kb’den büyük) entegrasyonu etkin biçimde gerçekleşir. • DNA/RNA’nın nükleaz sindiriminden korunması (kapsüllenme yoluyla) • Düşük hücre toksisitesi • Düşük maliyet • Çeşitli bitki hücre tiplerine uygulanabilir. OLUMSUZ YÖNLERİ: • Zahmetli ve düşük etkinlikli 28

MİKROLAZER • Lazer ışığının hücre zarı ve duvarında delik oluşumuna yol açaması ile ortamdaki DNA’nın hücre içerisine aktarımının gerçekleşmesi • Olumsuz yönü; DNA’nın hücre duvarına absorbsiyonu sonucu DNA’nın hücre içerisine giremeyişi • Diğer doğrudan yöntemlerin alternatif bir yöntem uygulanamayacağı durumlarda 29

Agrobacterium tumefaciens Aracılığı ile Gen Aktarımı

En genel anlamıyla bitkilere gen aktarımı; fonksiyonel olarak belirlenmiş doğal ya da sentetik nukleik asit dizilerinin bitki hücrelerine genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak aktarılmasıdır. Genetik transformasyon olarak adlandırılan bu süreç: yabancı nukleik asit molekülünün hücreye girişi (insersiyon ) genoma bağlanması (entegrasyon) , genin anlatımın yapması (ekspresyon; ifade) yavru döllere aktarımı aşamalarından oluşur.

Agrobacterium , toprakta doğal olarak yaşayan , gram negatif , spor oluşturmayan , hareketli , çubuk şekilli (Basil ) bir bakteri olup , yaralanmış dokulardan organizmaya girerek tümör benzeri dokular oluşturur.

Başta böğürtlen, ahududu, tüm meyve ağaçları , pek çok çalı formu ve asmalarda , özellikle hanımeli ve gülgiller gibi odunsular , papatya , yıldız çiçekleri , krizantem gibi otsular ve sebzeler olmak üzere yaklaşık 10 000 dikotilde ve otlar ve tahıllar gibi monokotillerde taç tümör (crown gall) oluşumuna neden olur.

A. tumefaciens ‘in taç tümör oluşurmasının nedeni sahip olduğu Ti (Tumour İnducing= tümör oluşumunu teşvik eden) plazmid ‘in T-DNA bölgesini bitki genomuna entegre etmesidir. Ti plazmid 4 bölgeden oluşmuştur. Vir bölgesi T-DNA aktarımı için gerekli Ori bölgesi replikasyon orijin noktası Opin bölgesi bakteri metabolizması için gerekli olan proteinlerin , octopin ve nopalinin katabolizmasından sorumlu gen bölgesi. T-DNA bölgesi 24 bp’lık sağ ve sol sonlanma bölgeleriyle sınırlandırılmış , bitki büyüme düzenleyici ve opin genlerini taşıyan , bitkilerde tümör oluşumdan sorumlu bölge.

T-DNA AKTARIMINDA GEREKLİ OLAN ÖĞELER 1) T-DNA bölgesi 2) Vir genleri 3) Kromozomal genler T-DNA’nın bir bitki hücresine aktarımı 4 aşamada gerçekleşir: 1. Agrobacterium’un bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması 2. Virulens genlerin uyarılması 3. T-DNA transferi 4. T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonu

Tİ PLAZMİDİN BİTKİLERE GEN AKTARIMINDA KULLANILMASI www. youtube. com/watch? v=L 7 qn. Y_Gqyt. M&t=9 s

POLEN TÜPÜ YOLU İLE GEN TRANSFERİ • Tozlaşmanın ardından DNA’nın kesilmiş stigma yüzeyine uygulanması ile gen transferinin gerçekleşmesi (DNA’nın polen tüpünden geçerek ovule varması). • İlk olarak pirinç transformasyonunda uygulandı (Oldukça yüksek sıklıkta transgenik bitki elde edildi). • Sonraları, buğday, soya, Petunia hybrida ve karpuz gibi diğer türler için de kullanıldı. 37

ZİGOTİK EMBRİYOYA DNA EMDİRİLMESİ • İzole edilen embriyoların DNA solüsyonu ile muamelesi sonrasında DNA transferinin gerçekleşmesi • Embriyoları izole etmek için uygulanan işlemlerin belirli ölçülerde hücrelere zarar vermesi ile DNA’nın hücrelere girişinin kolaylaşması • Yeterli düzeyde geçici gen anlatımı elde edilememiştir. 38

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ • Silikon karbid sert seramik bir maddedir ve kırıldığı zaman kolayca keskin kenarlar oluşmaktadır. • Silikon karbid fiberler 10 -80 µm uzunluğunda ve 0. 6 µm mikrofiberlerdir. çapında 39

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ • Bitki materyali (süspansiyon kültüründeki hücreler, embriyolar ve kalluslar gibi) DNA ve silikon karbit fiberler içeren tampon içerisine aktarılır ve daha sonra kuvvetli bir biçimde karıştırılır. • Silikon karbid fiberler ve süspansiyon hücreleri arasındaki çarpışma sonucu fiberler hücre duvarına ve plazma membranına delik açılmasına neden olur ve böylece DNA’nın hücre içerisine girişi sağlanır ve bitki hücrelerinin kararlı transformasyonu gerçekleşir. 40

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ • Scanning elektron mikroskobu ile fiber muameli bitki hücrelerinde bu ince fiberlerin hücre duvarını penetre etme yeteneğini açıkıça gösterilmektedir. Embriyonik mısır kallusunun silikon karbid fiberler aracılı transformasyonunun 41

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ • 1994 yılında Frame; silikon karbid fiberler aracılığıyla embriyonik mısır süspansiyon kültürü hücrelerini bakteriyel bar ve gus genleri taşıyan plazmid DNA’sıyla transforme etti. • Transforme edilmiş hücreler bialafos herbisidi içeren besiyerinde seçildi. • Analiz edilen tüm bialafos dirençli kallus hatlarında bar geninin girişi ve pat enziminin etkinliği onaylandı. • Verimli transgenik mısır bitkileri rejenere edildi • Herhangi bir türdeki transgenik bitki üretiminin ilk raporudur. 42

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ Fiberler aracılı mısır transformasyonu: (a) Işık mikroskobu altında, süspansiyon hücrelerinin silikon karbid fiberler aracılı transformasyonu (b) Transformasyondan sonra geçici GUS ekspresyonu hücrelerde (c) Bialafos dirençli kallus (d) Püskül oluşumu (e) Fiberler aracılı transforme edilen mısır bitkisi (f) Herbisit püskürtülmesinden 2 hafta sonra R 1 soyu (Transforme olmamış kontrol bitkileri 4 gün içinde şiddetli nekrosis gösterdi ve kısa sürede öldü, transgenik bitkiler ise yeşil ve sağlıklı). 43

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ • Fiberler kullanılarak; • Mısır, tütün, pirinç, buğday, Lolium multiflorum, Lolium perenne, Festuca arundinacea ve Agrostis stolonifera’nın transformasyonu gerçekleşti. 44

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ Bu yöntemin etkinliği: – – Fiberin boyutuna Vorteksleme parametrelerine Bitki materyaline Bitki hücrelerinin karakteristiğine 45

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ OLUMLU YÖNLERİ • Hızlı • Kolay • Ucuz yöntem • Çeşitli bitki materyalleri için kullanışlı • Hücre duvarını uzaklaştırmaya gerek yok 46

SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ OLUMSUZ YÖNLERİ • Düşük transformasyon etkinliği • Hücrelerde meydana gelen hasar rejenerasyon yeteneğini olumsuz etkiler. • Laboratuvar çalışmaları sırasında çok fazla özenli önlem protokollerine uyma gereği vardır (Fiberleri solumak önemli solunum hastalıklarına neden olabilir). 47

Biyolistik

Elektroporasyon

SONİKASYON • Ses dalgalarının hücreler arası ve hücre zarında boşluklar açarak serbest DNA parçalarının hücre içerisine girişini sağlayan bir yöntem 50

SONİKASYON • 1990 yılında Joersbo ve Brunstedt tarafından rapor edildi: • 35 S promotörüyle birleşen CAT (kloramfenikol asetil transferaz) geni içeren plazmidin varlığında 20 k. Hz ultrasona kısa maruz bırakma uygulanması yoluyla şeker pancarı ve tütün protoplastlarına DNA girişi gerçekleşti. • Hafif sonikasyon (20 KHz ultrason) DNA aktarımını kolaylaştırmak için kullanıldı. • Bu yöntem, aynı materyal için elektroporasyon yönteminden daha üstün bulundu (Elektroporasyon sisteminden daha kolay bir yöntem). https: //www. youtube. com/watch? v=RDTX-Le 6 zq. I 51

DESİKASYON Dokuların: • Önce soldurulması • Daha sonra aktarılmak istenen DNA’nın da bulunduğu bir ortamda tekrar su alımı • DNA’nın hücre içerisine aktarımı 52

SONUÇ • Bitkilerde gen transferi, bazı özel gen dizilerinin bitki hücrelerine genetik mühendisliği yöntemleri kullanılarak aktarılmasıdır. • Bu gen transfer yöntemleri, nükleik asitlerin sırasıyla bitki hücre duvarından, plazma ve nukleus zarından geçerek hücrenin canlılığına zarar vermeyecek şekilde geliştirilmiştir. • Doğrudan gen transfer yöntemlerinin Agrobacterium sistemine göre üstünlükleri; çeşitli bitki türlerine uygulanabilmesi ve aktarılan genin anlatımının kısa bir süre içerisinde saptanabilmesidir. • Bitkilere gen aktarımı ile; çeşitli çevresel baskılara, bakteriyel, viral ve fungal hastalıklara, herbisitler ve pestisitler gibi çeşitli kimyasal bileşiklere dayanıklılık özelliği kazandırılması • Tahılların besin kalitesinin arttırılması, bitkilerin sekonder metabolitler, antibiyotikler ve aşılar gibi ilaç endüstrisinde kullanılan maddeleri bol miktarda üretmeleri 53