BOSNA I HERCEGOVINA MINISTARSTVO SIGURNOSTI BIH AGENCIJA ZA
BOSNA I HERCEGOVINA MINISTARSTVO SIGURNOSTI BIH AGENCIJA ZA FORENZIČKA ISPITIVANJA I VJEŠTAČENJA Forenzička laboratorija – biološka vještačenja i DNK analiza Una Tulić, viši stručni suradnik za biološka vještačenja
An expert is one who knows more and more about less and less until they know absolutely everything about nothing… (Nicholas Butler, 2005)
FORENZIČKA BIOLOGIJA JESTE PRIMJENA BIOLOŠKIH ZNANJA I METODA U KRIVIČNO-PRAVNIM ISTRAGAMA. PREMA MODERNIJEM PRISTUPU FORENZIČKA BIOLOGIJA FOKUSIRA SE NA POLJE FORENZIČKE BOTANIKE, MIKROBIOLOGIJE I ENTOMOLOGIJE, TE ANIMALNE FORENZIKE I DJELOMIČNO ANATOMIJE I FIZIOLOGIJE. FORENZIČKA ANTROPOLOGIJA I GENETIKA NAJČEŠĆE SE PRIKAZUJU KAO SAMOSTALNE GRANE FORENZIKE.
FORENZIČKA DNK ANALIZA MOŽE SE PRIMJENITI DA SE IDENTIFIKUJU: 1. 2. 3. 4. 5. 6. POČINITELJI KAZNENIH DIJELA ŽRTVE ZLOČINA NESTALE OSOBE ŽRTVE MASOVNIH KATASTROFA DOKAZIVANJE OČINSTVA (PONEKAD I MAJČINSTVA) ŽRTVE RATA http: //whyfiles. org/2011/tsunami-the-killer-wave/
BIOLOŠKI TRAGOVI SU UVIJEK PRISUTNI NA MJESTU ZLOČINA!
BIOLOŠKI TRAGOVI KOJI MOGU POSLUŽITI ZA IDENTIFIKACIJU I INDIVIDUALIZACIJU JESU: -KRV I KRVNE STANICE, -SPERMA I SJEMENE STANICE, -TKIVA I ORGANI, -KOSTI I ZUBI, -KOSA, PRHUT I NOKTI, -SLINA, MOKRAĆA, FECES I DR. TJELESNE TEKUĆINE KOJE MOGU SADRŽATI EPITELNE STANICE, -EPITELNE STANICE.
IZAZOVI PRI RADU SA BIOLOŠKIM TRAGOVIMA - TRAGOVI POMJEŠANI SA TVARIMA KOJE TOKOM ANALIZE MOGU PREDSTAVLJATI INHIBITORE - BIOLOŠKI TRAGOVI MOGU BITI MJEŠAVINE KOJE VODE PORIJEKLO OD DVA ILI VIŠE IZVORA (MJEŠANI TRAGOVI) - TRAGOVI MOGU BITI KOLIČINSKI JAKO MALI ŠTO MOŽE PREDSTAVLJATI OGRANIČAVAJUĆI FAKTOR U DALJNJOJ ANALIZI - BIOLOŠKI TRAGOVI MOGU BITI IZLOŽENI NEPOVOLJNIM UVJETIMA SREDINE ŠTO MOŽE DOVESTI DO DEGRADACIJE DNK - UZROCI DEGRADACIJA: a) toplota b) kiša c) direktna osunčanost d) tlo i bakterije i gljive iz njega, te humidna kiselina e) laboratorijske kemikalije (npr. varikina) - KONTAMINACIJA : - SA UZORKA NA UZORAK - SA OSOBE NA UZORAK
PAKOVANJE BIOLOŠKIH TRAGOVA SA MJESTA ZLOČINA KRV I TJELESNE TEKUĆINE NIKADA SE NE SMIJU PAKOVATI VLAŽNE!!! PREDMETE NA KOJIMA SE NALAZE BIOLOŠKI TRAGOVI POŽELJNIJE JE PAKOVATI U PAPIRNE KESE, A NE PLASTIČNE! UZORCI SE NE SMIJU SUŠITI FENOM ILI NA DIREKTNOM SUNCU.
U LABORATORIJI SE PREDMETI SA BIOLOŠKIM TRAGOVIMA PREGLEDAJU: VIZUELNO PRELIMINARNI TESTOVI KONFIRMATORNI TESTOVI SPECIFIČNI ZA VRSTU
NAKON IDENTIFIKACIJE BIOLOŠKOG MATERIJALA PRISTUPA SE IZOLACIJI BIOLOŠKOG TRAGA U SVRHU DALJNJE DNK ANALIZE. DNK U STANICAMA SE NALAZI U JEDRU (nuklearni genom) I MITOHONDRIJAMA (mitohondrijalni genom). TRAGOVI KOJI SE MOGU ISPITATI NEKOM OD METODA DNK ANALIZE OGRANIČENI SU NA ONE KOJI SADRŽE STANIČNU JEZGRU. (S IZUZETKOM KADA SE ISPITUJE MITOHONDRIJSKA DNK)
USPJEŠNOST IZOLACIJE DNK I DETEKCIJE DNK PROFILA OVISI O VIŠE FAKTORA: • KOLIČINI UZORKA, • STUPNJU RAZGRADNJE DNK, • ČISTOĆI UZORKA. OSNOVNA PODJELA BIOLOŠKIH TRAGOVA JESTE NA (FORENZIČKI TRAGOVI) I NESPORNE TRAGOVE. SPORNE SAKUPLJANJE BIOLOŠKIH TRAGOVA U SVRHU DNK ANALIZE MORA BITI PO PRECIZNO STANDARDIZIRANOJ PROCEDURI SA JASNO DEFINIRANIM ODREDNICAMA KOJE SE MORAJU OBAVEZNO POŠTOVATI I DOSLJEDNO PRATITI. OVO JE JEDAN OD NAJVAŽNIJIH PREDUVIJETA ZA OSIGURANJE KVALITETNE DETEKCIJE VALIDNIH DNK PROFILA (Marjanovic & Primorac, 2009).
MJESTO ZLOČINA TRANSPORT LABORATORIJSKA ANALIZA ISO 17025
• NAKON PRELIMINARNIH VJEŠTAČENJA BIOLOŠKIH TRAGOVA PRISTUPA SE EKSTRAKCIJU UKUPNE GENOMSKE DNK. OSNOVNI KORACI KOD RAZLIČITIH METODA DNK EKSTRAKCIJE JESU: 1. LIZA STANICA, 2. PURIFIKACIJA I UKLANJANJE PCR INHIBITORA, 3. PRIKUPLJANJE UZORKA. ŠIROKO PRIMJENJENE METODE DNK EKSTAKCIJE DANAS U FORENZIČKIM LABORATORIJAMA: - METODA ORGANSKE EKSTRAKCIJE, - IZDVAJANJE DNK “CHELEXR 100” METODOM, - IZDVAJANJE DNK “QIAGEN” METODOM, - PROMEGA IQTM SYSTEM.
NAKON IZOLACIJE DNK RADI DALJEG MANIPULISANJA POTREBNO JE ODREDITI NJENU KOLIČINU NEKOM OD METODA KVANTIFIKACIJE: 1. 2. 3. SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE KOLIČINE DNK, VIZUALIZACIJA DNK NA AGAROZNOM GELU, HIBRIDIZACIONA (SLOT-BLOT) METODA, 4. Quanti. Blot HUMAN DNA QUANTITATION KIT, 5. Alu. Quant. R HUMAN DNA QUANTITATION SYSTEM, 6. QRT-PCR KVANTIFIKACIJE, 7. Quantifiler. R Duo DNA IDENTIFICATON KIT.
POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA • OVO JE NAJOSJETLJIVIJA METODA U PROCESU DNK ANALIZE. • KORISTI SE ZA AMPLIFIKACIJU ODREĐENOG REGIONA DNK ČIME JE U POTPUNOSTI RJEŠEN PROBLEM MALE KOLIČINE POLAZNE DNK, KOJI JE GODINAMA BIO GLAVNI OGRANIČAVAJUĆI FAKTOR.
DNK PROFIL
STR (SHORT TANDEM REPEATS) MARKERI • STR MARKERI JESU KRATKE PONAVLJAJUĆE SEKVENCE, A SASTOJE SE OD 2 -7 (2 -10) DUGIH BAZNIH PAROVA KOJI SE NA LOKUSU PONAVLJAJU ODREĐENI BROJ PUTA.
POŽELJNE OSOBINE NEKOG STR LOKUSA JESU: • • • IZRAŽENA HETEROZIGOTNOST, MALA MOLEKULARNA TEŽINA, JASNO DEFINIRANE REPETATIVNE JEDINICE, JASNO DETERMINIRANE ALELNE VARIJANTE, JEDNOSTAVNA I POUZDANA AMPLIFIKACIJA. STR MARKERI KOJE DANAS KORISTOMO U GENETIČKOM PROFILIRANJU SU UGLAVNOM TETRA- ILI PENTA-NUKLEOTIDI JER SE TAKO POSTIŽU REZULTATI SA VISOKOM RAZINONOM INDEKSA ISKLJUČIVANJA. CODIS (Combined DNA Indexing System) OSNOVNI SET OD 13 STR TETRANUKLEOTIDNIH LOKUSA NEOPHODAN ZA UNOŠENJE DNK PROFILA U CODIS BAZU KOJU JE FORMIRAO FBI SREDINOM 90 -IH.
PREKO 99 % HUMANE DNK JE JEDNAK KOD SVIH OSOBA. OKO 0, 5 % RAZLIKA ZA KOJE DANAS ZNAMO JE DOVOLJNO DA SE DNK DVIJE INDIVIDUE POUZDANO MOŽE RAZLIKOVATI (OSIM KAO SE RADI O JEDNOJAJČANIM BLIZANCIMA). STR MARKERI NALAZE SE U NEKODIRAJUĆIM REGIONIMA (ONIM DIJELOVIMA DNK KOJI NE SUDJELUJU U KODIRANJU PROTEINA).
NAČIN PRENOŠENJA STR LOKUSA SA RODITELJA NA POTOMSTVO.
Amelogenin je gen smješten na spolnim kromosomima i razlikuje se kod muškaraca i žena u deleciji od 6 bp što omogućuje da se pomoću ovog gena odredi spol individue.
POWERPLEXTM 16 SYSTEM
AMPFLSTRR IDENTIFILERTM PCR AMPLIFICATION KIT
D 3 S 1358 Primjer elektroferograma dobivenog iz mješanog uzorka Amel VWA D 8 S 1179 D 5 S 818 FGA D 21 S 11 D 18 S 51 D 13 S 317 D 7 S 820
OSTALI DNK MARKERI KOJI SE KORISTE U FORENZIČKOJ GENETICI: VNTR (VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS) – RFLP analiza minisatelitnih markera HIPERVARIJABILNI REGION mt. DNK SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISAMS)
Način prenošenja mt. DNK preko majčinske linije.
USPOREDBA DNK MARKERA (Butler, 2005):
HVALA NA PAŽNJI! Alma Filipović-Žunić, stručni savjetnik za analizu DNK a. filipovic_zunic@afiv. gov. ba Una Tulić, viši stručni suradnik za biološka vještačenja u. tulic@afiv. gov. ba Agencija za forenzička ispitivanja i vještačenja Nikole tesle b. b. 71123 Istočno Sarajevo Tel: +387 57 320 300, Fax: +387 57 320 303
- Slides: 29