BIOTECNOLOGIE Per BIOTECNOLOGIE si intendono tutte le pratiche
BIOTECNOLOGIE Per BIOTECNOLOGIE si intendono tutte le pratiche finalizzate all’utilizzo di organismi viventi o di processi biologici con lo scopo di ottenere prodotti utili • Biotecnologie antiche – si selezionavano gli organismi viventi a seconda delle caratteristiche comparivano naturalmente • Biotecnologie moderne – Si provvede direttamente al miglioramento genetico deli organismi viventi attraverso • Incroci selettivi (si spostano da un organismo all’altro interi gruppi di geni dalla funzioni ignote) • Ingegneria genetica (si spostano da un organismo all’altro singoli geni dalla funzioni note)
DNA RICOMBINANTE L’ informazione genetica contenuta nel DNA è specifica per ogni individuo di una specie. Unendo porzioni di DNA di due individui diversi, si ottiene un organismo dotato di un genotipo ibrido che manifesta nel fenotipo le caratteristiche di entrambi gli individui di partenza. Questo esperimento è stato realizzato per la prima volta nel 1973 da due genetisti americani: Cohen e Boyer. I due ricercatori trasferirono in un batterio di E. coli, i geni per la resistenza di due antibiotici, provenienti ciascuno da ceppi di batteri differenti. Il nuovo batterio era in grado di resistere a entrambi gli antibiotici. Fu l’ inizio dell’era del DNA ricombinante BOYER COHEN Con il termine di Dna ricombinante si indica ogni molecola di Dna in cui sia presente informazione genetica proveniente da due o più organismi differenti
La tecnica del DNA ricombinante si basa sui seguenti presupposti: • Uniformità del codice genetico • Complementarietà delle basi • Disponibilità di forbici e colla molecolari • Possibilità di amplificare enormemente la quantità di DNA • Possibilità di coltivare in vitro, le cellule Questa rivoluzionaria tecnica biologica è stata messa a punto in seguito alla scoperta: • della transcrittasi inversa • degli enzimi di restrizione
TRASCRITTASI INVERSA pag 249 Libro di Biologia
ENZIMI DI RESTRIZIONE
Palindromo- Frase che ha lo stesso significato letta nei due sensi es- "i topi non avevano nipoti". Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA, idrolizzando il legame fosodiesterico tra due nucleotidi adiacenti. La caratteristica degli enzimi di restrizione è che tagliano il DNA in corrispondenza di sequenze palindromiche del Dna producendo dei frammenti chiamati frammenti di restrizione Gli enzimi di restrizione funzionano pertanto come delle forbici Estremità coesive o sfalsate Uno degli enzimi di restrizione più usati è Eco. RI (si legge eco-erre-uno). La sigla si riferisce al batterio in cui l’enzima è stato trovato, al ceppo del batterio e al momento in cui è stato individuato. Eco dalle iniziali di Escherichia coli, R indica il ceppo RY 13 e I specifica che si tratta della prima endonucleasi trovata in questo batterio.
-GATATC-CTATAG-GAT ATC-CTA TAGESTREMITA’ PIATTE Eco. RV (ECO-ERRE-CINQUE)
SEPARAZIONE DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE TRAMITE ELETTROFORESI Poiché ogni individuo ha una particolare sequenza di basi azotate lungo il filamento di DNA, il numero e la lunghezza dei filamenti cdi restrizione che si ottengono usando lo stesso enzima di restrizione , varia da individuo. Questo fenomeno è noto come POLIMRFISMO DELLA LUNGHEZZA DEI FRAMMENTI D I RESTRIZIONE (RIFLIP). I frammenti di restrizione possono essere separati mediante ELETTROFORESI
Jake and Ema's four children were grown and had families of their own. Jake was murdered. WHO IS THE KILLER?
PLASMIDI pag 252 Libro di Biologia figura 1 Molti batteri presentano piccole molecole di DNA circolare esterne al DNA, chiamate plasmidi. I plasmidi si duplicano in sintonia con il cromosoma batterico e questo li rende dei vettori ideali per trasferire dei geni all’interno di una cellula ricevente. A questo scopo i plasmidi batterici sono stati modificati in laboratorio per ottenere dei vettori plasmidici. Tutti i vettori plasmidici contengono tutta una serie di elementi essenziali • Un Ori (origine della duplicazione - per consentire una duplicazione tutte le volte che si verifica una divisione cellulare • Un gene reporter (o gene marker) - che contiene uno o più geni per la resistenza ad antibiotici) per consentire di selezionare le cellule contenenti il vettore. Come plasmidi si possono usare anche quelli che hanno come reporter il gene per la proteina verde fluorescente (GFP) che emette luminescenza verde quando è colpita da luce ultravioletta. • Un sito multiplo di clonaggio - Che contiene un certo numero di sequenze di riconoscimento per diversi enzimi di restrizione. Queste sequenze sono poste una vicina all’altra (nella figura 1 sono indicate dalla freccia) in una regione dove avverrà l’inserimento del DNA esogeno.
LA TECNICA DEL DNA-RICOMBINANTE PER COSTRUIRE UN DNA RICOMBINANTE , SI PROCEDE IN QUESTO MODO: 1. Procurarsi il DNA che contiene i geni che interessano 2. Procurarsi un vettore plasmidico 3. Tagliare il DNA ed il vettore plasmidico, entrambi con lo stesso enzima di restrizione, in modo da ottenere delle estremità coesive 4. Unire insieme le estremità coesive del DNA e del plasmidio. Per questo si ricorre all’ enzima DNA ligasi che come una ’’colla ‘’ è in grado di ricostituire il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti. 5. Inserire il plasmide ricombinante all’interno della cellula ricevente 6. Selezionare le cellule riceventi contenenti il plasmide per ottenere molte copie dello stesso gene (CLONAGGIO)
LA TECNICA DEL DNA-RICOMBINANTE
Temperatura ottimale teorica: 37°C Temperatura ottimale reale: 4°-16°C
ESISTE IL PERICOLO DELLA RICIRCOLARIZZAZIONE VETTORE • • DNA Bassa concentrazione di DNA favorisce le ricircolarizzazioni Alta concentrazione di DNA favorisce il legame intermolecolare (inserto-vettore)
La ricircolarizzazione si può evitare trattando il vettore con fosfatasi alcalina per rimuovere i gruppi fosfati Riparate dagli enzimi della cellula ospite NICK
COME INSERIRE UN PLASMIDE RICOMBINANTE IN UNA CELULA RICEVENTE L’ inserimento di un plasmide ricombinante in una cellula ricevente prende il nome di TRASFORMAZIONE se la cellula è batterica o TRASFEZIONE se si tratta di una cellula eucariotica. Le principali tecniche per ottenere questo scopo sono le seguenti: • SHOCK TERMICO (per batteri) – Le cellule batteriche vengono immerse in un soluzione concentrata di ioni calcio a bassa temperatura (2 -4 °C). Questi ioni, carichi positivamente si legano ai lipopolisaccaridi della parete batterica e attraggono il DNA che è negativo . La temperatura viene poi innalzata oltre i 40 °C e riportata velocemente a 2 -4 °C . Questi shock termico provoca la dilatazione dei pori a livello della parete cellulare permettendo l’ingresso degli ioni calcio e quindidel vettore plasmidico. • ELETTROPORAZIONE (per batteri e cellule eucariotiche) – Le cellule sono sottoposte per pochi secondi a un campo elettrico che alterando il potenziale elettrico di membrana provoca l’ apertura di canali che consentono l’ ingresso del vettore. • PISTOLA PER BOMBARDAMENTO BIOLISTICO (per cellule vegetali) – I plasmidi da inserire vengono adesi a particelle di’ oro o tungsteno che poi vengono sparate attraverso la membrana cellulare , con una speciale pistola ad aria compressa, detta pistola genica • MICROINIEZIONE (per cellule embrionali) – Il vettore plasmidico viene iniettato direttamente all’ interno della cellula grazie a un minuscolo ago di vetro utilizzato al microscopio con l’aiuto di uno speciale strumento: il micromanipolatore
PISTOLA PER BOMBARDAMENTO BIOLISTICO MICROINIEZIONE
RICONOSCIMENTO DELLE CELLLULE TRASFORMATE E CLONAGGIO DEL DNA RICOMBINANTE E’ necessaria una premessa. Per CLONAGGIO si intende la produzione di copie multiple di una data molecola; per CLONAZIONE invece si intende la produzione di organismi geneticamente identici a quelli di partenza definiti CLONI. Per riconoscere tra i batteri quelli che effettivamente hanno incorporato il plasmide vettore, è sufficiente far crescere i batteri in corrispondenza dell’antibiotico specifico per il vettore utilizzato, dal momento che i vettori plasmidici contengono un gene marker per la resistenza a quello specifico antibiotico. Solo quelli che hanno incorporato il vettore e che quindi esprimono il gene per la resistenza, possono sopravvivere. In questo modo si ottiene un colonia batterica pura contenente il DNA esogeno. Tutte le volte che i batteri si dividono duplicano oltre che i loro geni anche quelli contenuti nel vettore. Da una singola cellula batterica, dopo 30 divisioni (circa 10 ore) si ottengono 230 cellule geneticamente identiche (CLONAZIONE), corrispondenti a oltre un miliardo di copie del gene inserito, utili per l’analisi del gene stesso e la determinazione del suo prodotto (CLONAGGIO) PLASMIDE RICOMBINANTE INSERITO IN BATTERI batteri Batteri trasformati Batteri non trasformati FORMAZIONE DI COLONIE BATTERICHE batteri
Data l’elevata capacità di ricombinazione genetica da parte dei batteri c’è la probabilità di selezionare batteri che non hanno incorporato il plasmide, ma che sono diventati resistenti a quell’antibiotico per mutazione. In tal caso si può abbinare al marker per un antibiotico quello per la proteina verde fluorescente (GFP). I batteri trasformati, emettono una luminescenza verde quando sono illuminati da luce ultravioletta.
IMPIEGO DELL’ OPERONE-LAC PER UNA SELEZIONE PIU’ SICURA Premessa necessaria: teoria dell’operone (libro Biologia pag 256)
LATTOSIO Β-galattosidasi Colonie ricombinanti (bianche) Colonie non ricombinanti (blu) X-GAL BLU
IMPIEGO DELL’ OPERONE-LAC PER UNA SELEZIONE PIU’ SICURA Il plasmide contiene il gene selvatico (o wild type) lac. Z+ che codifica la betagalattosidasi, in grado di scindere il lattosio nei due monomeri glucosio e galattosio. . All’interno di questo gene è presente il sito di clonaggio, in corrispondenza del quale, avviene l’inserimento di DNA esogeno. Come si può notare nella figura se un frammento di DNA viene inserito nella regione del sito di clonaggio, si determina un’inserzione nel gene lac. Z+; il codice di lettura per la beta-galattosidasi viene interrotto e non può essere prodotta beta-galattosidasi funzionale. Se una cellula batterica viene trasformata dal solo plasmide non ricombinante, in presenza di lattosio e di un substrato cromogeno della betagalattosidasi, come l’X-gal (5 -bromo-4 -cloro-3 -indolil-beta-galattoside), la betagalattosidasi scinde l’X-gal in un prodotto colorato precursore dell’indaco. Le colonie batteriche quindi assumeranno un colore blu. Se nel gene lac. Z+ del plasmide vettore è stato inserito del DNA estraneo, e quindi il vettore è diventato un vettore ricombinante, le cellule batteriche trasformate non producono più una betagalattosidasi. Pertanto in presenza di lattosio (l’induttore artificiale dell’operone lac) e di X-gal, quest’ultimo in mancanza dell’enzima betagalattosidasi non può essere più trasformato nel precursore dell’indaco. Le colonie batteriche quindi, trasformate con un vettore ricombinante, saranno bianche
GENE TRASCRITTO A COMANDO PLASMIDE La molecola del DNA ricombinante è formata da: 1. Gene umano per l’insulina (rosa) 2. DNA del plasmide (azzurro) che contiene • gene marcatore resistenza alla penicillina (verde) • promotore (nero) segnale regolativo che permette al gene di essere trascritto nelle cellula ospite • gene interruttore operone lac (giallo) Trasferimento in E. Coli e riconoscimento dei trasformanti Assenza di lattosio nel mezzo significa assenza di espressione del transgene Coltivazione trasformanti Presenza di lattosio nel mezzo significa espressione del transgene
VIRUS COME VETTORI Come vettori possono essere utilizzati anche i VIRUS BATTERIOFAGI che svolgono un ciclo litico come il batteriofago lambda. Nel genoma di questi fagi si introduce un sito di clonaggio per un ‘enzima di restrizione , in modo da consentire di saldare all’interno del genoma virale il DNA esogeno. Il vantaggio offerto dai batteriofagi lambda, è quello di poter ospitare frammenti di DNA più lunghi rispetto ai vettori plasmidici. Il gene esogeno non viene integrato, ma si comporta nelle cellule infetta come un plasmidio. Per inserire stabilmente un gene all’interno del genoma della cellula ricevente si utilizzano i RETROVIRUS che sono in grado di integrare il loro genoma all’interno del genoma della cellula infettata CICLO LITICO RETROVIRUS
COME ISOLARE I GENI DA CLONARE Premessa : geni discontinui e splicing libro biologia pag 267 -268 TRASCRIZIONE FIG. 2 TRADUZIONE 55’ ESONE FIG. 3 ESONE m. RNA maturo ESONE 3’ AAAAA
COME ISOLARE I GENI DA CLONARE Adesso che si sa come preparare una molecola di DNA ricombinante, bisogna spiegare come si fa ad isolare un frammento di DNA che contiene il gene da clonare. In merito sono necessarie alcune premesse. I geni degli eucarioti sono discontinui; a porzioni codificanti dette esoni si alternano porzioni non codificanti dette introni (vedi fig . 2). Durante la trascrizione vengono trascritti sia gli esoni che gli introni. Pertanto l’ m. RNA che si ottiene non può essere subito tradotto. A tal fine deve subire un processo di maturazione ; è necessario cioè che gli introni vengano rimossi. Attraverso un processo chiamato di SPLICING (fig. 3) gli introni vengono tagliati e gli esoni vengono cuciti insieme. Al termine dello splilcing all’ esremità 3’ del filamento di m. RNA si aggiunge una sequenza di 200 nucleotidi A (coda poli A) con l’intento di facilitare il legame con i ribosomi. Fatte queste premesse appare evidente che il DNA genomico (il DNA del nucleo) non è il materiale ideale per isolare i geni. I geni infatti non sono maturi perché contengono ancora gli introni. Conviene pertanto partire dagli m. RNA maturi dal momento che questi rappresentano i geni (circa il 5%) che effettivamente sono espressi dalla cellula di un tessuto; e i geni espressi variano da tessuto
COME ISOLARE GLI m. RNA DA UNA CELLULA Per isolare gli m. RNA da una cellula si sfrutta la presenza alla loro estremità 3’ della coda poli A. Dapprima le cellule vengono frammentate in modo da liberare tutti gli acidi nucleici. Gli m. RNA contenuti nell’estratto cellulare vengono messi in una colonna di separazione che contiene una resina a base di agarosio in cui sono presenti dei pezzetti di DNA a singolo filamento detti oligonucleotidi la cui sequenza è costituita solamente da timine (poli T). Gli oligonucleotidi poli T si appaiano alla coda poli A degli m. RNA trattenendoli nella resina mentre gli altri acidi nucleici vengono eliminati con un lavaggio. Successivamente con l’aggiunta di un tampone gli m. RNA purificati si staccano dalla resina e dai poli T e possono essere così recuperati. IL PASSO SUCCESSIVO È QUELLO DI COSTITUIRE UNA GENOTECA O LIBRERIA DI c. DNA MATERIALE GENETICO TOTALE
TECNICA PER OTTENERE UNA GENOTECA CELLULE si isola m. Rna totale presente in una cellula Trascrittasi inversa DNA genomico (30000 geni) taglio con enz. di restr. Gli m. RNA sono copiati in c. DNA (a doppio filamento dalla trascrittasi inversa. I geni così ottenuti corrispondono al DNA maturo privato dagli esoni Frammenti di DNA genomico Plasmid. I Plasmidi Molecole di DNA ricomb. Introduzione plasmidi In batteri. Selezione e clonaggio GENOTECA GENOMICA Costituita da tanti cloni ognuno contenente un diverso frammento di DNA GENOTECA di c. DNA Costituita da tanti cloni contenente ciascuno un diverso c. DNA. E ’diversa da tessuto
GENOTECHE • GENOMICHE - contiene i geni ottenuti da tutto il DNA di un cellula, anche quelli che non sono espressi. I geni non sono maturi perché contengono ancora gli introni. • di c. DNA - contiene solo i geni che si esprimono in una cellula (circa il 5%) ottenuti a partire da m. RNA maturo. I geni sono privi di introni La biblioteca ottenuta sarà diversa per ogni tipo di tessuto
LE SONDE PESCANO I c. DNA NELLE GENOTECHE (pag 173 -174) Cercare un singolo c. DNA dentro una genoteca è come cercare un libro in una biblioteca senza catalogo, in cui i libri sono mescolati tra loro senza alcun ordine preciso I c. DNA vengono «pescati» usando come «esca» una sequenza nucleotidica (detta sonda) complementare a quella del gene interessato Le sonde sono pezzi di DNA o RNA a filamento singolo, naturali o artificiali, lunghi da 1000 nucleotidi, complementari ad una sequenza dei nucleotidi del gene che si vuole trovare e con il quale si ibridano. c. DNA sonda ATTGACTTGATCAAGGCTA TAACTGAACTAGTTCCGAT Per renderla facilmente individuabile, la sonda viene marcata con isotopi radioattivi o con sostanze fluorescenti. Volendo estrarre un gene specifico dalla genoteca, basterà mescolare la massa di c. DNA con una certa quantità della sonda radioattiva che pescherà il c. DNA voluto ibridandosi con esso. L’allestimento della sonda implica la conoscenza a priori della sequenza del gene. Se questa non è nota si parte dalla proteina e sfruttando il codice genetico si risale dalla sequenza amminoacidica alla corrispondente sequenza di nucleotidi. PROTEINA DETERMINARE LA SEQUENZA AMMINOACIDICA SINTETIZZARE LA SONDA SETACCIARE UNA GENOTECA Con tale sequenza si può costruire una sonda sintetica con cui pescare nella genoteca,
ISOLAMENTO DEL c. DNA TRAMITE IBRIDAZIONE SU COLONIA Trattasi di una variante del SOUTHERN BLOTTING Filtro di nitrocellulosa Carico positivamente Sonda radioattiva a DNA marcata con 32 P A contatto con il filtro la sonda si ibrida con il c. DNA specifico ATTGACTTG TAACTGAAC • Sulla superficie di una piastra Petri, contenenti le colonie di una libreria c. DNA, viene appoggiato un filtro di niitrocellulosa. • Alcune cellule della colonia aderiscono al filtro che successivamente viene immerso in una soluzione in grado di lisare le cellule e liberare gli acidi nucleici. • Il DNA che ha carica negativa, rimane attaccato al filtro carico positivamente. Il DNA così esposto viene quindi denaturato per separare i due filamenti • A questo punto si introduce la sonda che si ibriderà con il CDNA specifico • Poiché il filtro è una specie di fotografia della piastra da cui deriva, dalla posizione della sonda è possibile identificare quali cellule contenevano il c. DNA che stiamo cercando. Le cellule sono prelevate e fatte moltiplicare in modo da ottenere una coltura pura. Sonda radioattiva c. DNA
ISOLAMENTO DEL DNA TRAMITE TECNICA DEL SOUTHERN BLOTTING Questa tecnica prenede il nome dal suo ideatore il biologo britannico Edwin. Southern Con il termine blotting si intede il trasferimento e l’immobilizzazione di acidi nucleici da un gel o una soluzione acquosa a un supporto solido, generalmente una membrana di nitrocellulosa o nylon. L’ intero genoma viene tagliato con enzimi di restrizione. I frammenti di restrizione vengono separati in base alla grandezza per elettroforesi . I frammenti di DNA vengono denaturati (95°C) e trasferiti su un foglio di nitrocellulosa. Foglio di nitrocellulosa Sonda radioattiva a DNA marcata con 32 P N, B. Se il materiale da isolare è RNA e non DNA la tecnica è sostanzialmente la stessa e per analogia viene chiamata NORTHERN BLOTTING
REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI (PCR) Premessa duplicazione del DNA LA DUPLICAZIONE PROCEDE IN DIREZIONE 5’ – 3’
REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI (PCR) La PCR è una tecnica che permette di ottenere molte copie di un gene Prima dello sviluppo di questa tecnica (ideata dal chimico Kary Mullis nel 1985). L’unico metodo per ottenere molte copie di un gene era il clonaggio del DNA, che comporta come si è visto, l’inserimento di un gene in cellule batteriche a loro volta replicano il gene quando si dividono. Il processo della PCR si svolge invece in una singola provetta, mescolando semplicemente il DNA con una serie di reagenti e ponendo il tutto in un termociclatore. Questo apparecchio mediante una serie ripetuta di di riscaldamento e di raffreddamento permette di ottenere in poche ore , partendo anche da una piccola quantità di DNA milioni di copie di un gene. Questa tecnica richiede la presenza di: • Porzione di DNA che ci interessa • I quattro desossiribonucleotidi del DNA( A, G, T, C) • Primers • DNA polimerasi resistente al calore ricavata dal batterio Thermus aquaticus (Taq) Mullis
Per eseguire la PCR si usa qualunque porzione del Dna, di cui devono essere note le sequenze iniziali e finali, perchè in queste posizioni vanno inseriti i primers. I primers sono piccoli filamenti di DNA, complementari alle sequenze d’ inizio dello stampo che provvedono a dare inizio al processo dal momento che la DNA polimerasi non è in grado da sola di sintetizzare ex novo filamenti di DNA Un ciclo PCR consiste di tre tappe: 1. Denaturazione. Il DNA è scaldato a 94 °C per 5 minuti. A questa temperatura il Dna si denatura e i due filamenti si separano provvedendo ciascuno a fungere da stampo per la sintesi di nuovo DNA 2. Ibridazione. La temperatura del termociclatore viene abbassata a 40 -45°C permettere ai due primers di legarsi alle sequenze d’inizio. I primers delimitano la regione di DNA che deve essere copiata. 3. Estensione. La DNA polimerasi sintetizza la regione di DNA compresa tra i due primers ad una temperatura di 72 °C. Come DNA polimerasi si usa quella del batterio Thermus aquaticus perché non si denatura alle alte temperature. 4. Di nuovo, 1, 2, 3. Poiché ad ogni ciclo il DNA si raddoppia, dopo 35 cicli si ottengono 3, 5 x 10 14 copie
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) DNA Replication PCR DENATURING DNA Helicase Temperature ANNEALING RNA Primers DNA Primers EXTENSION DNA Polimerase Taq Polimerase
APPLICAZIONI DELLA PCR • Applicazioni in criminologia perché permette di utilizzare anche frammenti infinitesimali di DNA • Per identificare la presenza di agenti infettivi come i virus dell’ HIV, della epatite e del papilloma virus in particolare permette di identificare in modo precoce il virus dell’HIV all’interno delle cellule umane, a differenza della diagnosi tradizionale che basandosi sulla presenza degli anticorpi dà responsi settimane se non mesi dopo il contagio. • Per identificare piccole mutazioni dei geni responsabili di tumori o di malattie come la fibrosi cistica, l’ anemia falciformre la fenilchetonuria, la distrofia muscolare
SEQUENZIAMENTO DEL DNA CON IL METODO DI SANGER Confronto fra d. NTP e dd. NTP La DNA polimerasi procede in direzione 5’ 3’ aggiungendo desossiribonucleotidi all’estremità 3' dell’ ultimo nucleotide inserito. Se l’ultimo nucleotide inserito, fosse un didesossiribonucleotide, l’assenza del gruppo –OH in posizione 3’, impedirebbe la formazione del legame fosfoestere e di conseguenza l’aggiunta di un altro nucleotide alla catena in crescita. Pertanto la sintesi si arresterebbe nella posizione in cui all’estremità in crescita è stato aggiunto il didesossinucleotide
SEQUENZIAMENTO DEL DNA pag. 179 (pag 302 Biologia) Per sequenziare un tratto di DNA occorrono: • Frammenti denaturati del tratto di DNA da sequenziare • DNA polimerasi • Primers • I quattro desossiribonucleosidi trifosfati • i quattro didesossiribonucleosiditrifosfati ciascuno legato ad una sostanza fluorescente che emette una luce di diverso colore - + ADENINA – GIALLO TIMINA – VERDE GUANINA – BLU CITOSINA - ROSSO
GENOMICA Grazie alla possibilità di sequenziare il genoma è nata una nuova branca della biologia molecolare: la genomica. Data l’enorme quantità di dati da elaborare e visualizzare, questa nuova scienza si basa sulla bioinformatica. Si riconoscono vari ambiti della genomica: • Genomica funzionale – si prefigge lo scopo di determinare tutti i geni che costituiscono il genoma di un specie • Genomica comparativa – si prefigge di confrontare il genoma di due più specie per definire i rapporti di parentela tra le specie stesse. • Metagenomica – si occupa dell’analisi dei genomi d tutte le specie presenti in un determinato ambiente al fine di determinarne la variabilità gennetica ossia la biodivesità.
PROGETTO GENOMA UMANO Il Progetto genoma umano (HGP, acronimo di Human Genome Project) è stato un progetto di ricerca internazionale il cui obiettivo principale era quello di determinare la sequenza delle coppie di basi azotate che formano il DNA e di identificare e mappare i geni del genoma umano. Il progetto è stato completato il 22 giugno 2003 dal Genome Bioinformatics Group della UCSC, composto da Jim Kent, Patrick Gavin, Trrence Furey e David Kulp. Inoltre fu sostenuto da Renato Dulbecco genetista premio Nobel ottenuto nel 1975. Il sequenziamento del DNA umano ha riservato alcune sorprese: • Il genoma umano è costituito solo per il 2 % da sequenze codificanti pari a 21000 geni, molti meno rispetto agli 80000 – 15000 ipotizzati • Il restante 98 % è costituito da DNA di cui non si conosce ancora a fondo la funzione anche se ormai sembra coinvolto in processi di regolazione. • Mediamente i geni umani sono lunghi 27000 paia di basi azotate • I geni non sono distribuiti uniformemente nel genoma. Ad es il cromosoma 19 è densamente popolato di geni, mentre il cromosoma 8 ne è largamente sprovvisto
TRANSCRITTOMICA E TECNOLOGIA MICROARRAY DI DNA SONDE di DNA Benché tutte le cellule contengano lo stesso patrimonio genetico, soltanto alcuni geni vengono espressi a seconda di quale tessuto la cellula entra a far parte. La trascrittomica è quella branca delle biologia molecolare che ha lo scopo di determinare quali geni e in che quantità, sono espressi in un determinato momento nelle cellule di un determinato tessuto. A tal fine si ricorre alla tecnonologia microarray di DNA. POZZETTO MICROARRAY A livello pratico si procede in questo modo: 1. In laboratorio si sintetizzano oligonucleotidi a singolo filamento (sonde) che hanno una sequenza complementare a quella di ciascun gene del genoma Questa sequenza funge da etichetta del gene che lo identifica in maniera univoca. Queste sonde, nella quantità di pochi picogrammi (1 pg = 10 -12 ), vengono inserite in pozzetti (spot) presenti su sottili supporti di silicio (microarray o Gene chip) di 1, 5 cm di larghezza, 1, 5 cm di lunghezza e 1 mm di spessore. Un microarray appare quindi come una griglia con migliaia di spot, in ciascuno dei quali c’è una sonda che corrisponde a un gene. Un microarray può contenere tutti i 20000 geni del genoma umano
CELLULA m. RNA Transcrittasi inversa c. DNA denaturazione c. DNA a singolo filamento Marcati con un gruppo fluorescente Applicazione al microarray MARCATORE FLUORESCENTE c. DNA IBRIDAZIONE TRA SONDA E c. DNA 2. Dal tessuto che si vuole analizzare si estraggono gli m. RNA che sono convertiti in c. DNA tramite la transcrittasi inversa. Di seguito sono denaturati per convertirli in filamenti a singola elica e marcati con un gruppo fluorescente. Infine sono applicati al microarray 3. Ciascun c. DNA si ibrida alla sonda presente sul microarray con la sequenza a lui complementare.
4. Illuminando il microarray con un raggio laser, i pozzetti corrispondenti alla presenza di un c. DNA legato alla sua sonda , emettono radiazioni fluorescenti La lettura del microarray pemette quindi di stabilire quali geni sono espressi in un dato momento nelle cellule di un determinato tessuto. Inoltre, dall’intensità della fluorescenza è possibile stabilire l’ entità dell’espressione.
APPLICAZIONI DELLA TECNOLOGIA DEI MICROARRAY DI DNA Cellule tumorali Cellule normali Estrazione m. RNA Conversione in c. DNA geni espressi tessuto normale geni espressi tessuto tumorale geni espressi in entrambi i tessuti geni non espressi c. DNA Denaturazione e marcatura con sostanze fluorescenti diverse Combinazioni In uguale quantità FIG. 1 Ibridazione con le sonde della griglia Leucemia mieloide acuta Leucemia linfoide acuta
La tecnologia dei microarray trova diversi campi di applicazione in medicina, soprattutto nella diagnostica dove ad esempio si confronta l’espressione genica in un tessuto tumorale rispetto ad uno sano. La figura 1 mostra come confrontare l’espressione genica in due tipi cellulari diversi : cellule tumorali (rosse) , cellule normali (azzurre) La preparazione del microarray richiede i seguenti passaggi. 1. Isolamento dell’m. RNA dai due campioni cellulari. 2. Conversione in c. DNA tramite transcrittasi inversa 3. Denaturazione e marcatura dei c. DNA con marcatori fluorescenti (fluorocromi); rosso per le cellule tumorali, verde per le cellule normali 4. Il c. DNA delle cellule tumorali, viene mescolato in egual quantità con il c. DNA delle cellule normali. La miscela è versata sul microarray e lasciata incubare per 12 ore a 42 °C in modo che possa avvenire l’ibridazione tra le molecole di c. DNA e le sonde 5. Dopo 12 ore il microarray è lavato per eliminare i c. DNA che non si sono ibridati. 6. Con uno scanner si analizza il microarray. Si può notare che gli spot hanno diverso colore a. Spot luminosi verdi – corrispondono ai geni espressi in un tessuto normale b. Spot luminosi rossi – corrispondono ai geni espressi in un tessuto tumorali c. Spot luminosi gialli – corrispondono ai geni espressi in un tessuto normale e normale d. Spot luminosi neri – corrispondono ai geni non espressi. 7. Analisi. Il tumore è dovuto a mutazioni a carico dei geni che controllano la divisione cellulare. Sapere quali geni si esprimono in una forma tumorale aiuta a capire il meccanismo di formazione neoplastica. Differenti tipi di cancro esprimono gruppi di geni diversi. La tecnologia microarray aiuta a diagnosticare il tipo di tumore cui è affetto un paziente e quindi di scegliere tempestivamente la terapia più adeguata.
PROTEOMICA La proteomica si prefigge lo scopo di determinare le proteine (proteoma) che costituiscono l’espressione genica di una cellula. L’ analisi del proteoma consiste nelle seguenti fasi: • Estrazione delle proteine per centrifugazione • Separazione delle proteine per elettroforesi - si sfuttano le differenti cariche elettriche delle proteine
Proteina nativa Proteina trattata con SDS Carica netta - 4 Carica netta -
APPLICAZIONI DELLA TECNICA DEL DNA-RICOMBINANTE Un organismo che si trova ad avere nel proprio genoma un gene proveniente da un’ altra specie, viene chiamato organismo transgenico, mentre il gene estraneo è detto transgene. Qualunque organismo il cui genoma sia stato modificato dall’ingegneria genetica, non necessariamente per l’ aggiunta di un gene estraneo è detto organismo geneticamente modificato o OGM • BIOTECNOLOGIE AGRARIE • BIOTECNOLOGIE AMBIENTALI • BIOTECNOLOGIE MEDICHE
BIOTECNOLOGIE AGRARIE
PIANTE TRANSGENICHE Se si prende un frammento del tessuto di una pianta e lo si mette in un terreno di coltura in presenza di giusti ormoni, si ottiene una masserella di cellule indifferenziate detta CALLO Questo se coltivato in opportune condizioni ambientali, darà origine ad una pianta geneticamente identica alla pianta madre. Se nelle cellule del callo, prima della rigenerazione si introducono alcuni geni esogeni, si ottiene una pianta transgenica
Per trasferire nuovi geni nelle piante si utilizza un particolare plasmide, detto plasmide Ti derivato dal batterio patogeno vegetale Agrobacterium tumefaciens. Quando questo batterio aderisce a una cellula vegetale, trasferisce al suo interno una porzione del proprio plasmide Ti (detta T-DNA) integrandola nel cromosoma della pianta. Il T-DNA contiene geni che inducono la proliferazione delle cellule infette , generando tumori nella pianta colpita.
Nel T-DNA del plasmide Ti viene inserito , ricorrendo agli enzimi di restrizione , un DNA esogeno (fig. 1, 2, 3). Il plasmide Ti-ricombinante è introdotto in cellule di Agrobacterium tumefaciens prive del plasmide Ti naturale (Fig. 4). A questo punto, infettando con l’ A. tumefaciens le cellule del CALLO, il gene inserito nel t-DNA, insieme a questo sarà trasferito e integrato nel cromosoma della cellula (fig. 5 -6). Da queste cellule trasformate si possono ottenere dei cloni di piantine tutte geneticamente identiche, contenenti il gene esogeno
ESEMPI DI PIANTE TRANSGENICHE Piante ad elevato contenuto nutrizionale Golden rice- La vitamina A è una vitamina presente in molti alimenti; quali carote, uova burro. Questa vitamina, svolge un ruolo importantissimo nella visione e nella differenzazione cellulare. Il riso , cereale alla base dell’alimentazione in vaste aree dell’ Asia, e tuttavia povero di Vitamina A. La conseguenza è che in India e in estremo oriente, 250 milioni di bambini soffrono di carenza di vitamina A, una condizione che causa 2 milioni di decessi all’anno ed è una delle principali cause di cecità infantile. Nel 2000, utilizzando A. tumefaciens è stato creato un riso transgenico contenente due geni per la sintesi della vitamina A che si accumula nei chicchi conferendo loro un caratteristico colore dorato da cui il nome Golden rice, Piante che producono oli ricchi di acidi grassi polinsaturi ω 3 Patate con un contenuto solido maggiore, in modo d’ assorbire meno olio durante la frittura GOLDEN RICE
Piante resistenti ai parassiti (piante Bt) Il batterio Bacillus thuringensis, un comune abitatore del suolo, contiene un gene detto gene cry che codifica per una proteina tossica nei confronti di molti insetti parassiti. La tossina è specifica per le larve d’insetto, mentre è innocua per i vertebrati oltre che per insetti benefici come le api. Con la tecnica precedentemente descritta il gene cry è stato inserito in molte piante di interesse agricolo tra cui mais , cotone , riso, ecc. Le piante transgeniche esprimono il gene cry, dette piante Bt, sono quindi resistenti a molti parassiti, con il vantaggio immediato che non serve più utilizzare i pesticidi chimici per proteggere i raccolti. E’ il più noto alimento transgenico molto più produttivo di quello naturale grazie alla presenza del gene cry che produce una tossina che uccide le larve di lepidotteri parassiti del mais Bacillus thuringensis
L’ USO DELLE RELAZIONI COOPERATIVE NATURALI ossia simbiosi tra piante e batteri azotofissatori o tra piante e funghi Premessa: il ciclo dell’azoto N 2 + 8 H+ + 8 e- + 16 ATP → 2 NH 3 + H 2 + 16 ADP + 16 Pi
Noduli radicali Erba medica
ALTRE APPLICAZIONI IN CAMPO AGRARIO • L’ allevamento animale • Fermentazioni
BIOTECNOLOGIE AMBIENTALI
BIORISANAMENTO L’ utilizzo di microorganismi per la rimozione di sostanze inquinanti presenti nell’ambiente è detto biorisanamento IL CASO DELLA EXXON VALDEZ. Il 24 marzo 1989 la superpetroliera Exxon valdez, naufragò in prossimità delle coste dell’Alaska, riversando in mare 40000 metri cubi di petrolio che contaminarono l’area costiera per 1500 Km. Per risanare il mare si fece ricorso non soltanto alle normali tecniche di risanamento (barriere, idrovore, ecc) ma si decise di sfruttare alcune specie di batteri geneticamente modificati, in particolare PSEUDOMONAS PUTIDA , in grado di utilizzare come fonte di carbonio, molti composti organici inquinanti presenti nel petrolio. Pseudomonas putida appartiene alla categoria dei batteri estremofili , capaci di vivere in condizioni ambientali estreme (geyser con tempetature prossime ai 100 gradi, laghi e mari molto salati, miniere ricche di minerali tossici, ecc. ) Gli enzimi che permettono loro di vivere in condizioni così estreme sono chiamati estremozimi Pseudomonas putida
BIOFILTRI I metalli pesanti come mercurio piombo, cadmio rilasciati dagli scarichi industriali, sono tra gli inquinanti più pericolosi e difficili da eliminare. Per questo sono allo studio batteri geneticamente modificati, in grado di rimuovere tali sostanze. Per esempio in batteri come E. coli, sono stati inseriti alcuni geni, provenienti da un batterio che permettono di assorbire mercurio attraverso la membrana cellulare. Ai batteri è stato introdotto anche il gene per la metallotionina , una proteina in grado di fissare il mercurio all’interno della cellula. I batteri ingegnerizzati, possono poi essere immobilizzati su un supporto solido per creare dei biofiltri in grado di assorbire il mercurio presente nell’acqua. BIOSENSORI Sono batteri in grado di rilevare la presenza di inquinanti nell’acqua o nel suolo. A questo scopo si usano batteri ingegnerizzati con il gene per la proteina fluorescente verde GFP proveniente dalle meduse e con un promotore che si attiva solo quando nel mezzo di coltura è presente solo un certo inquinante. Pertanto quando la proteina viene sintetizzata il batterio diventa luminescente. Con questa tecnica sono stati realizzati biosensori per la rilevazione di metalli pesanti e idrocarburi. PROMOTORE GFP
PRODUZIONE DI COMPOST Il compostaggio è una delle più comuni applicazioni biotecnologiche industriali. Si definisce compostaggio la trasformazione mediante fermentazioni, della frazione umida dei rifiuti solidi urbani e degli scarti della lavorazione agricola in terriccio, detto compost, da usare come fertilizzante. • Nella prima fase del processo, intervengono i batteri mesofili, che lavorando a temperature comprese tra 25 °C e 45 °C, operano l’ ossidazione aerobica del materiale organico. • Quando la temperatura degli strati interni supera i 50°C e l’ ambiente è saturo di CO 2 , intervengono i batteri termofili anaerobi, che completano la fermentazione. • A questa fase segue il processo di maturazione in cui sono coinvolti soprattutto i funghi che operano la demolizione delle sostanze più complesse come la lignina e le cellulosa e portano alla formazione del compost.
BIOCOMBUSTIBILI
BIOCOMBUSTIBILI Un’ alternativa ai combustibili fossili è rappresentata dai biocombustibili come il bioetanolo e il biodiesel , sintetizzati attraverso processi fermentativi di masse vegetali. I biocombustibili hanno un impatto ambientale pressoché nullo in quanto liberano solo la CO 2 fissata durante la vita della pianta e non quella intrappolata migliaia di anni fa. Il bioetanolo si ottiene per fermentazione degli zuccheri a partire da mais, sorgo, canna da zucchero, legno di recupero, paglia, ecc. Il biodiesel si ottiene per raffinazione di oli vegetali come quello di colza, di soia di palma. Una fonte particolarmente conveniente per la produzione di bioetanolo è rappresentata dagli scarti della lavorazione del legno, dalla paglia , dalla buccia dei frutti. Queste biomasse sono ricche di carboidrati, ma presentano anche molecole complesse a struttura fibrosa e molto resistenti alla decomposizione come la lignina e la cellulosa. Per rendere sfruttabili questi scarti, è necessario, prima demolire queste sostanze liberando gli zuccheri di cui sono composti, . A tal fine si sono creati dei batteri ingegnerizzati in cui si sono potenziate le vie enzimatiche di degradazioone la cellulosa e la lignina. BIOMASSE Paglia , rifiuti lavorazione legno, ecc IDROLISI ENZIMATICA Si ottiene glucosio batteri ingegnerizzati FERMENTAZIONE ETANOLO
BIOTECNOLOGIE MEDICHE
PRODUZIONE DI FARMACI BIOTECNOLOGICI Produzione di insulina da parte di batteri per curare il diabete di tipo I dovuto ad una produzione insufficiente di insulina
COME VIENE PRODOTTA L’ INSULINA NELLE CELLUE UMANE m. RNA insulina sequenza segnale serve per la secrezione dell’ ormone all’esterno A C traduzione B L’ m. RNA dell’insulina comprende il messaggio di quattro parti distinte della proteina: • Sequenza segnale • Catena A • Catena C • Catena B A Preproinsulina (inattiva) B INSULINA
Se forniamo ai batteri il gene dell’insulina, questi si attengono scrupolosamente alla traduzione letterale del messaggio, formando preproinsulina inattiva PORZIONE DI DNA CHE CODIFICA PER CATENA A PORZIONE DI DNA CHE CODIFICA PER CATENA B Ricombinazione con plasmidi e inserzione in E. coli Estrazione catena A Combinazione e sintesi INSULINA Estrazione catena B
ANTICORPI MONOCLONALI – MAB • circa 7000/mm 3 • FAGOCITI • LINFOCITI
FAGOCITI risposta aspecifica fagocitosi GRANULOCITI • Presenza di grossi granuli visibili dopo colorazione • si dividono in: • Neutrofili (coloranti neutri) • Eosinofili (coloranti acidi) • Basofili (coloranti basici) •
MONOCITI • sono i più grandi • grosso nucleo a forma di ferro di cavallo
LINFOCITI risposta specifica (anticorpi) • Gli anticorpi sono proteine che riconoscono una specifica combinazione di amminoacidi detta epitopo presente su di una proteina estranea (es. la proteina di rivestimento esterno di un virus) che costituisce l’antigene • LINFOCITI B • LINFOCITI T LINFOCITA B LINFOCITA T
LINFOCITI B (bone marrow) - IMMUNITÀ DI TIPO UMORALE • I linfociti B (bone marrow) rimangono nel midollo osseo dove maturano • agiscono all’esterno della cellula (gli anticorpi non possono entrare all’internodi una cellula)
LINFOCITI T (da timo) - IMMUNITÀ DI TIPO CELLULARE • I linfociti T (da timo) maturano nel timo per trasferirsi dopo la loro maturazione nei linfonodi. • Uccidono personalmente le cellule infettate
COME SI PRODUCONO GLI ANTICORPI MONOCLONALI Milstein Kohler antigene milza Cellula tumorale di mieloma un tumore che interessa i linfociti B IBRIDOMA Da ogni singolo ibridoma si può far sviluppare un clone di cellule che producono un unico tipo di anticorpo detto monoclonale Da ogni ibridoma è anche possibile isolare il gene corrispondente a quell’anticorpo per inserirlo in altri organismi, per esempio le piante di tabacco per a produzione su larga scala
IMPIEGO DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI IN MEDICINA In ambito diagnostico • Test di gravidanza – grazie ai MAB è possibile rilevare nelle urine la presenza della gonadotropina corionica , l’ormone secreto dall’embrione al momento dell’annidamento. • Immunoscintigrafia IMMUNOSCINTIGRAFIA Grazie alla scintigrafia è possibile vedere le zone dove si accumulano gli anticorpi marcati, identificando la presenza e la collocazione del tumore.
Nell’ambito della ricerca • Microscopia a immunofluorescenza Utilizzando i Mab è stato possibile marcare le proteine che costituiscono i microtubuli del fuso mitotico e seguire dettagliatamente la sua formazione. Nell'uomo la sintesi della struttura cellulare per la corretta ripartizione dei cromosomi nelle cellule uovo, il fuso mitotico, richiede un tempo molto elevato e sfrutta meccanismi leggermente diversi rispetto ad altre specie. Questa differenza spiega perché nella nostra specie c'è un tasso relativamente elevato di anomalie cromosomiche, che spesso portano ad aborti spontanei. Nella mitosi il fuso mitotico è sintetizzato da un'apposita struttura, il centrosoma, che però manca nelle cellule uovo di diverse specie, fra cui la nostra, dove è sostituito dai cosiddetti centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC). Melina Schuh e colleghi, hanno ora scoperto che nell'uomo il fuso non è sintetizzato neppure dai MTOC, ma direttamente dai cromosomi. Questo meccanismo di sintesi è però molto più lento: mentre nel topo (in cui intervengono i MTOC) la creazione del fuso e il suo corretto posizionamento richiede 3 -5 ore, nell'uomo si arriva alle 16 -17 ore. Ciò fa sì che per 6 -7 ore il fuso in formazione sia instabile: i microtubuli non sono abbastanza lunghi da agganciarsi al citoscheletro, ma lo sono abbastanza da potersi aggrovigliare. Se ciò avviene uno o più cromosomi possono essere tirati nella cellula figlia sbagliata. determinare trisomie come la sindrome di Down
In ambito terapeutico • Terapia tumorale. Sulla superficie delle cellule tumorali sono presenti degli antigeni che non compaiono sulle cellule sane. L’ anticorpo monoclonale specifico per l’antigene tumorale viene associato a delle molecole killer che dopo il riconoscimento della cellula cancerosa entrano nel suo interno provocandone la morte, senza danneggiare le cellule sane circostanti. • Immunizzazione passiva - si intende la protezione immediata e di breve durata verso le infezioni, ottenuta mediante la somministrazione di anticorpi sotto forma di immunoglobuline o di antisieri. neonati di madri infette HBs. Ag positive (la somministrazione avviene effettuata immediatamente dopo il parto o entro le prime 12 h, combinata con la prima dose di vaccino. • Immunoprofilassi
TERAPIA ANTICANCRO CON GLI ONCOREPRESSORI Il 9% delle donne che ereditano un allele mutante BRCA 1 ha il 60% di probabilità di di sviluppare un tumore al seno entro i 50 anni, percentuale che sale all’ 82% entro i 70 anni. Di contro nelle donne che hanno ereditato due alleli normali la percentuale di rischio è del 2% BRCA 1 è l’oncorepressore del carcinoma ovarico-mammario Tramite la manipolazione genetica si potrebbe col tempo far in modo che la cellula riattivi un gene oncorepressore mutato in modo che si torni ad avere le due coppie normali.
Lo scopo della terapia genica è quello di sostituire i geni mancanti o difettosi con geni normali. Un esempio è dato dall’ ADA-SCID ( Severe Combined Immuno Deficiencies) una grave malattia dovuta alla mancata produzione da parte dei globuli bianchi, dell’enzima adenosina deaminasi (ADA). Quando manca l’ ADA, nell’organismo si accumulano tossine endogene che portano alla distruzione del sistema immunitario. In simili condizioni, lo organismo non è più in grado di difendersi infezioni banali, come un semplice raffreddore , che possono risultare mortali. La terapia ha dato timidi successi, l’unico inconveniente è che i vettori retrovirali, integrano il gene esogeno in posizioni casuali del genoma. Questo fatto può risultare un problema perché potrebbe bloccare l’espressione di un gene o alterarne la regolazione. Per questo motivo, si sono progettati vettori virali basati sul virus adeno -associato che integra il proprio genoma in un punto ben definito sul cromosoma 19 che porta il gene ADA TERAPIA GENICA 2. 1. Si prelevano cellule del midollo osseo che presentano la copia non funzionante del gene. ADA Un retrovirus è ingegnerizzato attraverso l’inserzione del gene ADA funzionante
TECNOLOGIA ANTISENSO Un altra malattia genetica che si sta tentando di curare con la terapia genica di sostituzione è la COREA DI HUNTINGTON una malattia genetica neurodegenertiva che colpisce la coordinazione muscolare e porta ad un declino cognitivo e a problemi psichiatrici. Esordisce tipicamente durante la mezza età; è la più frequente malattia a causa genetica nei quadri clinici neurologici con movimenti involontari anomali (che prendono il nome di còrea). È molto più comune nelle persone di discendenza europea occidentale rispetto a chi è di origine asiatica o africana. La malattia è causata da una mutazione autosomica dominante in una delle due copie di alleli di un gene codificante una proteina chiamata huntingtina, Attualmente, però, i migliori risultati vengono dalla tecnologia antisenso che porta allo spegnimento del gene. La tecnologia antisenso è usata per il silenziamento di alcuni geni al fine di evitare che esprimano le informazioni di cui sono portatori. GENE NON SILENZIATO GENE SILENZIATO
LE CELLULE SAMINALI NELLA TERAPIA GENICA Un particolare tipo di terapia genica prevede l’impiego delle cellule staminali. Le cellule staminali sono cellule primitive, non specializzate, dotate della capacità di trasformarsi in diversi altri tipi di cellule del corpo attraverso un processo denominato differenziamento cellulare. Le cellule staminali vengono classificate in quattro gruppi principali: • Staminali unipotenti - possono dare origine a un solo tipo di cellula. Per esempio, nel midollo osseo esistono cellule staminali che sono in grado di dare origine solo ai globuli rossi e non ai globuli bianchi. • Staminali multipotenti - che possono dare origine ad alcuni tipi di cellule. Sempre nel midollo osseo, esistono delle cellule staminali da cui si originano più tipi di staminali unipotenti (per esempio, quelle che danno origine ai globuli rossi e quelle per i vari tipi di globuli bianchi). • Staminali pluripotenti - originano tutti tipi di cellule MA NON POSSONO DARE ORIGINE A UN INTERO ORGANISMO; sono un esempio di staminali pluripotenti le cellule dell’ embrione nello stadio di blastula e del cordone ombelicale. • Staminali totipotenti - originano tutti tipi di cellule E POSSONO DARE ORIGINE A UN INTERO ORGANISMO; sono un esempio di cellule staminali totipotenti le cellule dell’embrione nello stadio di 4 cellule (morula).
Le cellule staminali unipotenti e multipotenti sono chiamate cellule staminali adulte (SSC) perché si trovano anche i diversi tessuti dell’ individuo adulto. Le cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo, per esempio, possono essere differenziate in tutti i tipi cellulari delle linee linfoide e mieloide. Le cellule staminali pluripotenti e totipotenti sono chiamate cellule staminali embrionali (ESC) CELLULE STAMINALI ADULTE EMATOPOIETICHE CELLULE STAMINALI EBRIONALI
CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE (Ipsc) Oggigiorno è possibile isolare e coltivare in laboratorio sia le SSC che le ESC da cui poter ottenere diversi tipi di cellule se non interi organi. Poiché l’ applicazione delle SSC è limitata l’ attenzione degli scienziati si è concentrata sulle ESC. Ora per ottenere cellule staminali pluripotenti è necessario sacrificare gli embrioni e nel caso si tratti di embrioni umani questo comporta notevoli problemi di carattere etico. Nel 2006 il ricercatore giapponese Shinya Yamanaka, premio Nobel per la Medicina nel 2012, mise a punto la tecnica per ottenere cellule pluripotenti indotte (i. PSC) da cellule adulte. La tecnica prevede di invertire il programma di differenziamento, riportando le cellule già differenziate a uno stato pluripotente simile a quello delle ESC. Per ottenere questo scopo, si deve: • introdurre nelle cellule adulte i geni per 4 fattori trascrizionali caratteristici delle ESC. L’espressione di questi geni causa il de-differenziamento cellulare. • Le i. PSC possono poi essere fatte re-differenziare in tipi cellulari diversi da quello di partenza.
CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE 3. Attraverso n vettore si introducono nelle cellule adulte i geni per 4 fattori trascrizionali caratteristici delle ESC. L’espressione di questi geni causa il dedifferenziamento cellulare.
Le i. PSC lasciano ben pensare ad un loro promettente impiego nella terapia genica Come esempio si consideri una malattia del fegato chiamata alfa-1. Alfa 1 è causata da una mutazione recessiva. Come risultato, una proteina prodotta nel fegato, e di solito rilasciata nel corpo per proteggerlo da danni, rimane intrappolata nel fegato dove causa cirrosi. Alfa-1 è una delle malattie genetiche più comuni e colpisce circa una persona su 2000. L'unico trattamento disponibile al momento è il trapianto di fegato che è un importante intervento chirurgico che tuttavia implica prendere farmaci per tutta la vita per evitare il rigetto dell'organo. Per ovviare a questo inconveniente, i ricercatori hanno combinato la tecnologia delle cellule staminali i. PSC con la terapia genica. Hanno preso delle cellule dalla pelle di un paziente con alfa-1 e le hanno riprogrammate in cellule staminali i. PSC. Hanno poi corretto i difetto genetico inserendo il gene funzionale ed infinele hanno trattate per farle differenziare cellule del fegato. Come cellule del fegato, hanno fatto un perfetto lavoro incluso una normale produzione e rilascio della proteina sana.
LE CELLULE STAMINALI SONO ALLA BASE DELLA MEDICINA RIGENERATIVA Le cellule staminali possono essere utilizzate, oltre che nella terapia genica, anche per rigenerare tessuti danneggiati. Ad esempio possono essere utilizzate : • Nei trapianti per sostituire cellule malate (ad es. le staminali ematopoietiche vengono utilizzate per rigenerare il midollo in pazienti affetti da leucemia). • Per rigenerare tessuti sani da impiantare nell’ospite al posto di quelli malati (ad es. per curare il morbo di Parkinson o il Diabete). • Per riparare tessuti danneggiati (ad es. la pelle ustionata o il tessuto cardiaco danneggiato da un infarto).
epidermide Su un gel di collagene si dispongono dei fibroblasti; le cellule del tessuto connettivale che producono la matrice extra cellulare. Su questo strato che funge da derma vengono fatte crescere delle cellule epidermiche. Al posto del gel di collagene si utilizzano dei supporti polimerici. derma
CLONAZIONE DI MAMMIFERI La pecora Dolly 1996
CLONAZIONE PRO E CONTRO PRO • Possibilità di ottenere un numero illimitato di copie con caratteristiche identiche; caratteristica importante in zootecnia • Salvaguardia e diffusione di specie minacciate dall’estinzione • Possibilità di stabilire confronti tra animali con lo stesso patrimonio genetico nel campo della patologia, dell’alimentazione , della farmacologia, ecc. (es quando si testerà un farmaco in vivo si potrà sapere esattamente come agisce perché gli animali trattati e quelli di controllo hanno la stessa fisiologia. CONTRO • Scarsissima possibilità di successo • Danni al DNA con rischio di aumento di tumori o diminuzione della durata della vita • Problemi di natura etica validi soprattutto per l’Uomo
ANIMALI TRANSGENICI Gli animali transgenici sono utilizzati in campo biomedico per: • Utilizzare un mammifero come bioreattore per la produzione di proteine umane • Studiare la funzione di geni specifici Per modificare un animale dal punto di vista genetico si possono utilizzare due tecnologie • Micro iniezione di uova fecondate • Manipolazione di cellule staminali embrionali (ESC)
MICROINIEZIONE DI UOVA FECONDATE produzione del fattore VIII della coagulazione TOPO FEMMINA cellula uovo fecondata TOPO MASCHIO Introduzione per microiniezione del retrovurus contenente il gene per il fattore VIII per la coagulaz. sangue, ormone della crescita, ecc) e sua incorporazione nel DNA della cellula ospite RETROVIRUS ingegnerizzato I COAGULAZIONE DEL SANGUE II IV VIII UOVO IMPIANTATO NELLA MADRE ADOTTIVA coagulo TOPI TRANSGENICI Dopo la nascita i topi vengono esaminati per verificare che il loro genoma contiene il gene per il fattore VIII. Il fattore VIII sarà prelevato dal sangue
Dopo i topi, queste tecniche sono state estese ad altre specie animali. Per esempio sono state generate mucche transgeniche , in grado di produrre latte umanizzato, ovvero contenente lisozima, lattoferrina (proteina globulare multifunzionale con attività antimicrobica, sia battericida che fungicida) e alfalattalbumina (proteina che attiva i processi protettivi e assorbitivi intestinali, mediante queste azioni modula lo sviluppo cerebrale) umane; questo latte, ha quindi proprietà nutritive molto simile a quello materno. Un’ applicazione molto interessante è il PHARMING che consiste nel creare, utilizzando le tecniche dell’ingegneria genetica piante e animali transgenici che producono proteine di interesse farmacologico. Ad esempio: • Sono state create pecore il cui latte contiene alte quantità di ormone della crescita umano, usato per curare patologie legate a ritardi della crescita nei bambini. • Sono state create piante di tabacco, di mais e di soia transgenici che producono anticorpi umani utili nella cura di molte patologie (infezioni virali, cancro). In altri casi le piante transgeniche, producono altre molecole come l’enzima glucocerebrosidasi, utilizzato nella terapia di una malattia neurodegenerativa; la sindrome di Gaucher.
MANIPOLAZIONE DELLECELLULE STAMINALI EMBRIONALI ES (Forme chimeriche). Prelievo di cellule ES da una blastula di topi marroni Inserimento del gene (verde) con un marker per la resistenza ad un antibiotico (rosso) nelle cellule ES Selezione delle cellule ES trasfezionate La balastocisti viene impiantata in una madre sostitutiva Inserimento delle cellule ES In un embrione di topi bianchi TOPI CHIMERA Le parti del topo con pelo marrone discendono dalle cellule ES del topo marrone e contengono il transgene, le parti del topo con pelo bianco derivano dalla blastocisti del topo bianco Per avere un topo che porti l’allele in tutte le sue cellule i topi chimera si incrociano tra loro
Manipolazione delle cellule staminali embrionali ES (Forme chimeriche) Nella tecnica della microiniezione di un uovo fecondato, il nuovo materiale genetico può inserirsi in qualunque parte del genoma. Invece con la manipolazione delle cellule ES è possibile inserire il transgene in una posizione ben precisa del genoma ed in particolare nei casi in cui l’obiettivo è quello di sostituire un allele specifico con un nuovo allele. Inoltre con questa tecnica il DNA estraneo non viene inserito nello zigote, ma nelle cellule staminali embrionali (ES) di un topo cioè a livello germinale. Pertanto in questo caso le modifiche si hanno, vengono trasmesse nella progenie. A livello pratico si procede così: • Dall’interno di una blastocisti si prelevano con una micropipetta cellule staminali embrionali ES che vengono trasferite in un terreno di coltura. • In questa coltura di cellule viene introdotto il gene che interessa e si provvede a selezionare le cellule trasformate. La selezione può essere fatta con un terreno che contiene un antibiotico specifico per il gene marker. • La blastocisti viene impiantata in una madre sostitutiva e dopo tre settimane si ha la nascita dei topolini. • Per facilitare l’identificazione dei topi che hanno incorporato le cellule ES , si usano solitamente cellule ES prelevate da blastocisti di topi marroni e si impiantano in embrioni di topi bianchi. I topi che hanno incorporato le cellule ES avranno il pelo a chiazze bianche e marroni e vengono chiamati chimere. • Le parti del topo con pelo marrone discendono dalle cellule ES ingegnerizzate e contengono il transgene, le parti del topo con pelo bianco derivano dall’embrione. Mediante incroci successivi si arriva ad avere topi che hanno il nuovo allele in tute le cellule
TOPI KNOCKOUT La manipolazione di cellule ES permette di ottenere topi knockout Un topo knock-out è un topo geneticamente modificato in cui è soppressa l’espressione di un determinato gene. Esseri umani e topi condividono il 97% del loro genoma ; anche il metabolismo murino è simile per molti aspetti a quello umano. Questo fa sì che i topi costituiscano degli ottimi organismi modello. Più precisamente quando si vuole verificare in quale processo sia coinvolto un gene, il migliore modo per farlo è disattivare quel gene in un topo e controllare quali sono le conseguenze. Vettore plasmidico Cellula ES Il gene (verde scuro) inserito in un vettore plasmidico viene inattivato dall’inserzione di un marcatore (verde chiaro) cellule ES TOPI KNOCKOUT
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