Biotecnologia ENGENHARIA GENTICA CLONAGEM DNA RECOMBINANTE TRANSGENIA TERAPIA

Biotecnologia ENGENHARIA GENÉTICA

► CLONAGEM ►DNA RECOMBINANTE └TRANSGENIA └ TERAPIA GÊNICA ►DNA-FINGERPRINT

1997: A REVOLUÇÃO DOLLY !

A ovelha foi sacrificada no Instituto Roslin, na Escócia, após ser diagnosticada com uma doença pulmonar progressiva comum em animais velhos.

Cachorros O animal mais recentemente clonado!!! -

Clones Brasileiros § Bovinos

Células Tronco

1 2 3 4 5 6 7 botão interno trofoblasto As primeiras células embrionárias

Nidação – Início da gravidez -O blastocisto Parede uterina Trofoblasto Cavidade uterina

A VIDA ATÉ O NASCER Óvulo não fecundado fora do folículo SPTZ entrando no óvulo Óvulo fecundado OVO fecundação Óvulo não fecundado no ovário 12 semanas FETO SPTZ em direção ao óvulo na trompa UM SPTZ penetra a membrana do óvulo na trompa 1ª divisão celular – 24 hs Embrião – 10 dias 6 meses FETO COMPLETO 39 semanas RECÉM NASCIDO GOMES, FAM 2008

TRANSGÊNICOS

Aplicações: DNA recombinante: Transgênicos introdução de genes de uma espécie em outra espécie diferente Terapia Gênica Utilização de genes normais para substituir genes alterados cuja deficiência origina diversas doenças.

Funcionamento Molecular da Célula

Síntese de Proteínas

Tradução § Também chamada síntese de proteínas § Quando o RNAm chega ao citoplasma ele se associa ao ribossomo. Após essa associação os RNAt levam os aminoácidos, que serão ligados, formando assim a proteína.

• Quando o RNAm chega ao citoplasma, ele se associa ao ribossomo. • Nessa organela existem 2 espaços onde entram os RNAt com aminoácidos específicos. UAC AAA AUG UUU CUU GAC CCC UGA • somente os RNAt que têm seqüência do anticódon complementar à seqüência do códon entram no ribossomo.

• Uma enzima presente na subunidade maior do ribossomo realiza a ligação peptídica entre os aminoácidos. UAC AAA AUG UUU CUU GAC CCC UGA

• O RNAt “vazio” volta para o citoplasma para se ligar a outro aminoácido. UAC AAA AUG UUU CUU GAC CCC UGA

• O ribossomo agora se desloca uma distância de 1 códon. • O espaço vazio é preenchido por um outro RNAt com seqüência do anti-códon complementar à seqüência do códon. UAC AAA GAA AUG UUU CUU GAC CCC UGA

• Uma enzima presente na subunidade maior do ribossomo realiza a ligação peptídica entre os aminoácidos. UAC AAA GAA AUG UUU CUU GAC CCC UGA

UAC AAA AUG UUU GAA CUU GAC CCC UGA • O RNAt “vazio” volta para o citoplasma para se ligar a outro aminoácido. • e assim o ribossomo vai se deslocando ao longo do RNAm e os aminoácidos são ligados.

• Quando o ribossomo passa por um códon de terminação nenhum RNAt entra no ribossomo, porque na célula não existem RNAt com seqüências complementares aos códons de terminação. AUG UUU CUU GAC GGG CCC UGA Códon de terminação

GGG • Então o ribossomo se solta do RNAm, a proteína recém formada é liberada e o RNAm é degradado. AUG UUU CUU GAC CCC UGA

Considerações Finais § Uma proteína + de 70 aminoácidos ligados. § 1 códon 3 nucleotídeos no RNAm § 1 códon 1 aminoácido na proteína § Nº de ligações peptídicas Nº de aminoácidos – (menos) 1.

Considerações Finais § 1 anticódon 3 nucleotídeos no RNAt § O anticódon é complementar ao códon § Cada RNAt leva consigo apenas um tipo de aminoácido quem determina qual aminoácido será transportado é o anticódon.

Transcriptase RNA polimerase Replicação Transcrição DNA hn. RNA Tradução m. RNA Proteínas Transcriptase Reversa núcleo citoplasma

DNA RECOMBINANTE - TRANSGENIA ◘ introdução de genes de uma espécie em outra espécie diferente ◘ possível devido à universalidade do código genético Procedimentos: 1 - separar o gene desejado 2 - multiplicar este gene 3 - inserção no hospedeiro

DNA RECOMBINANTE - TRANSGENIA ◘ introdução de genes de uma espécie em outra espécie diferente ◘ possível devido à universalidade do código genético Procedimentos: 1 - separar o gene desejado 2 - multiplicar este gene 3 - inserção no hospedeiro

DNA recombinante: ferramentas - Vírus: infectam células e introduzem os genes desejados nas células; - Bactérias/ plasmídeos: sintetizam proteínas a partir de genes contidos em pedaços de DNA bacteriano (plasmídeo); - Enzimas de restrição: enzimas que cortam DNA em locais específicos.

Célula bacteriana Membrana plasmática Citoplasma Ribossomos Mesossomo Parede celular Cápsula Fímbrias Enzimas relacionadas com a respiração, ligadas à face interna da membrana plasmática Plasmídeos Nucleóide Flagelo DNA associado ao mesossomo

Transformação Molécula de DNA circular Célula bacteriana Fragmentos de DNA doador Lise celular Quebra do DNA Célula bacteriana Fragmentos de DNA ligam-se à superfície da célula receptora. O fragmento de DNA é incorporado à célula receptora. O fragmento de DNA é integrado ao cromossomo da célula receptora. Célula transformada

Cortar o DNA com enzimas de restrição Fragmento 1 Fragmento 3 Fragmento 2 Fragmento 4 Inserir fragmentos em vetores Introduzir vetores em bactérias

Transdução Fago O DNA de um fago penetra na célula de uma bactéria. Genes de outra bactéria são introduzidos e integrados ao DNA da bactéria hospedeira. O DNA do fago integra-se ao DNA da bactéria como um profago. Quando o profago inicia o ciclo lítico, o DNA da bactéria é degradado e novos fagos podem conter algum trecho do DNA da bactéria. DNA do fago com genes da bactéria O fago infecta nova bactéria. A célula bacteriana se rompe e libera muitos fagos, que podem infectar outras células.

DNA RECOMBINANTE - TRANSGENIA

Outros exemplos de transgênicos Planta de algodão resistentes às lagartas. Reduz a necessidade de utilização de pesticidas. Os gastos de produção diminuem e a poluição ambiental também é reduzida. Golden Rice. Arroz geneticamente modificado que contém um gene que codifica a produção de β-caroteno. Foi produzido para evitar que as populações pobres da Ásia adoecessem por avitaminoses.

Produção de insulina humana em bactérias: -Isola-se o gene da insulina humana utilizando-se enzimas de restrição para cortar o DNA humano; - Insere-se o gene em um plasmídeo bacteriano; - Ativa-se o plasmídeo, para a transcrição do gene e produção da proteína (insulina); - Retira-se a insulina da bactéria.

Como fazer uma vacina comestível Célula bacteriana Célula da planta Gene para o antígeno Transferência de genes DNA Plasmídeo Gene que confere resistência a certo antibiótico Suspensão de bactérias Agrobacterium tumefaciens Calo Células mortas Meio com antibiótico Batatas transgênicas que podem atuar como “vacina”

TERAPIA GÊNICA

Aplicações: DNA fingerprint (impressão digital de DNA): Determinação da identidade genética do indivíduo - Utilizado em testes de paternidade - Utilizado em biologia forense (resolução de crimes)

Como se faz DNA fingerprint: Íntron Éxxon Íntron Intron pedaço de cromossomo (DNA) sem função; Éxxon pedaço de cromossomo (DNA) funcional. 1º Passo: recortar pedaços de DNA com enzimas de restrição 2º Passo: mistura dos pedaços de DNA com “primers” radioativos 3º Passo: separação dos pedaços com eletroforese com gel de agarose

Gel de agarose + corrente e- Revelação UV

COLORAÇÃO

4º Passo: Comparação entre pedaços de DNA da mãe criança e dos supostos pais, em busca de semelhanças. Metade dos fragmentos de DNA devem ser iguais aos da mãe e a outra metade do pai.

Fitorremediação: Uso de sistemas vegetais fotossintetizantes e sua microbiota com o fim de desintoxicar ambientes degradados ou poluídos.

Tratamento de água com aguapé: Eichhornia crassipes Todas as macrófitas exercem importante papel na remoção de substâncias dissolvidas, assimilando-as e incorporando-as à sua biomassa, porém a espécie Eichhornia crassipes, o aguapé, tem sido a hidrófita mais estudada para o tratamento de água com plantas.

Descontaminação do Solo Bactérias Fungos Biorremediação: emprego dos microrganismos para a remediação de locais contaminados devido ao uso de agroquímicos. .

Poluição por esgotos doméstico e industrial

Poluição por esgotos doméstico e industrial Matéria orgânica biodegradável Bactérias, vírus, larvas e parasitas Explosão na população de microrganismos Coliformes fecais Þ doenças Consumo de oxigênio Brasil: 30% das praias são impróprias