Biotecnologa Vegetal Transformacin gnica en plantas Biotecnologa Vegetal

Biotecnología Vegetal Transformación génica en plantas

Biotecnología Vegetal • La biotecnología consiste en la utilización de organismos vivos con fines industriales • Conjunto de técnicas que utilizan organismos vivos o parte de ellos para obtener productos o modificarlos, para mejorar plantas o animales, o para desarrollar microorganismos con fines determinados • Se utilizan las técnicas de ingeniería genética y cultivo de tejidos vegetales in vitro

Planta transgénica Sistemas de Se introduce un DNA foráneo en el genoma de sus transformación células, este DNA se expresa y confiere a la planta un genética carácter o unos caracteres nuevos en plantas • Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. - Sistemas basados en virus vegetales. • Sistemas de transferencia directa de ADN - Transferencia por biobalística (micropartículas de oro o tungsteno que tiene aglomerado el DNA foráneo). - Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación - Transferencia por microinyección.

¿Para qué plantas transgénicas? • Rendimiento y calidad nutricional • Biorreactores • Estudio de procesos biológicos

Rasgos introducidos • Resistencia a: – insectos – herbicidas – virus, hongos, bacterias • Retraso de senescencia, tolerancia a estrés • Mejora del valor biológico (proteínas, lípidos) • Producción de polipéptidos de uso farmacológico.

Biotecnologías de apoyo al mejoramiento de plantas • Cultivo de tejidos • Rescate de embriones • Embriogénesis somática • Organogénesis somática • Producción de haploides • Fusión de protoplastos • Trasformación genética • Agrobacterium tumefaciens • Agrobacterium rhizogenes • Métodos directos • Métodos Indirectos

Cultivo de tejidos Factores comunes Composición general de medios de cultivo: • Fuente de Carbono (azúcares) • Macronutrientes (N, K, etc) • Micronutrientes (Fe, Cl, etc) • Vitaminas • Agente gelificante (para medios sólidos) • Reguladores de crecimiento (hormonas vegetales) • Otros compuestos (ej: agentes quelantes) ambientación asepcia cultivo

Cultivo de tejidos: Rescate de embriones

Cultivo de tejidos: Embriogénesis somática

Cultivo de tejidos: Organogénesis somática Propagación masiva • Flores • Frutales • Árboles forestales Cultivo de meristemas • Saneamiento de virus • Rejuvenecimiento

Cultivo de tejidos: Producción de haploides

Cultivo de tejidos: Fusión de protoplastos

Transformación genética Técnicas básicas • • Enzimas de restricción Clonación de genes Secuenciación Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN Hibridación con anticuerpos (western blot) Hibridación de ácidos nucleicos (southern, northern) Reacción de la polimerasa en cadena (pcr)

Transformación genética Técnicas básicas Enzimas de restricción Clonación en plásmidos (vectores)

Transformación genética Técnicas básicas Clonación en plásmidos (vectores)

Transformación genética Técnicas básicas Secuenciación A C G T

Transformación genética Técnicas básicas: Secuenciación

Transformación genética Técnicas básicas Electroforesis (DNA, RNA, proteinas) southern northern western

Transformación genética Técnicas básicas Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Métodos indirectos • Agrobacterium tumefaciens • Agrobacterium rhizogenes

Transformación genética: A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens Bacteria del suelo Gram (-) Tumor de tallo provocado por Agrobacterium tumefaciens Agallas en corona

Agrobacterium tumefaciens Bacteria Gram negativa que infecta a las plantas en lugares donde hay heridas y produce la enfermedad de las agallas en corona, fundamentalmente en Dicoteledóneas. Las agallas son protuberancias formadas por conglomerados de células indeferenciadas El plásmido Ti (tumor-inducing) es el responsable de la inducción de tumores, durante la infección se transfiere una porción definida de este plásmido: T-DNA (DNA de transferencia) La integración y expresión de ciertos genes del T-DNA (oncogenes) hace que las células transformadas se dividan sin control. Codifican para la síntesis de fitohormonas (auxinas y citoquininas) y de opinas (fuente de C y N para la bacteria).

¿Qué son los genes vir? • Codifican factores esenciales para la transferencia e integración del T-DNA dentro del genoma de la planta. • Están ubicados en una regíón de 35 kb del plásmido Ti fuera de la región del T-DNA. • Hay 25 genes vir distribuídos en 7 operones. • Responden a un metabolito secundario exudado por las plantas cuando se les provoca una herida (acetosiringona)

Transformación genética: A. tumefaciens

Vectores derivados del plásmido Ti • Componentes necesarios: – Marcador de selección (resistencia a kanamicina) – Origen de replicación (para que se replique en E. coli) – Borde derecho de la secuencia T-DNA – Polylinker (región de multiple clonaje) • Tipos: – binarios – cointegrados

Transformación genética: A. tumefaciens

Se inocula con Agrobacterium desarmada que contenga un vector de transformación. El T-DNA contiene un módulo de expresión y el gen de resistencia a la kanamicina El medio además de hormonas debe contener el antibiótico cefotaxima (para controlar el crecimiento de Agrobacterium) y kanamicina (antibiótico de selección)

Agrobacterium rhizogenes En este caso se utiliza como vector de transformación la bacteria con su plásmido Ri intacto y además se introduce otro plásmido que contiene los genes quiméricos dentro del T-DNA. Puede dar fenotipos aberrantes en la parte aérea de la planta Cultivo de raíces de tabaco transformadas por Agrobacterium rhizogenes Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus Gentileza del Dr. Mark Tepfer

Métodos directos • • Bombardeo de partículas (biobalistica) Electroformación de Protoplasto Fibras de carburo de silicio “Whiskers” Transformación mediada por Glicol de polietileno (PEG)

Transformación genética: Biobalística

Manipulación de la expresión génica • Promotores: – constitutivos (35 S del virus del mosaico del coliflor) – tejido específicos (FBPasa - Rubiscom) – inducibles • Secuencias “enhancer” • Intrones que estabilizan el m. RNA producido • Secuencia terminadora (nopalina sintasa)

Manipulación posttranscripcional • Antisentido – Se transfiere un gen que codifica para un RNA complementario (as. RNA) al m. RNA de interés. – Al transcribirse ambos genes se forma un híbrido as. RNA-m. RNA que impide la traducción del último.

GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO EN PLANTAS TRANSGÉNICAS Tipo de gen utilizado en transgénesis Caracter que confiere a la planta Toxina de Bacillus thuringensis Resistencia a Insectos Proteína de la cubierta viral Resistencia a Virus Quitinasas, glucanasas de plantas y de otros organismos Resistencia a Hongos Lisozima humana y de cerdo. Otros péptidos bactericidas Resistencia a Bacterias Genes cuyos productos afectan biosíntesis de aminoácidos, o fotosíntesis Resistencia a Herbicidas la la Genes cuyos productos afectan la biosíntesis del etileno, o la formación de pared celular Retraso maduración de frutos

ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS TRANSGÉNICAS (Birch, 1997) Cultivo (Fecha liberación) Nombre Compañía Caraterísticas Tomate (1994) Flavr Savr Calgene Savor de madurez en rama, largavida Zeneca Consistencia de pasta de tomate Tomate (1995) Algodón Papas Maiz (1996 -97) Bollgard New. Leaf Yield. Guard Monsanto Toxina de. Bacillus thuringiensis para resistencia insectos Soya Raps Algodón (95 -96) Roundup Ready Monsanto Resistencia a Glifosato (herbicida)

OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE MODIFICADAS Abeto Acelga Alfalfa Algodón Alamo Arabidopsis Arroz Arveja Camote Caña de azucar Cebada Centeno Clavel Crisantemo Espárrago Eucalyptus Frambuesa Frutilla Kiwi Lechuga Lirio Maíz Maní Manzana Maravilla Orquidea Papaya Petunia Pera Pino Plátano Poroto de soya Remolacha Repollo Rosa Sorgo Tabaco Tomate Tulipán Trigo Vides Zanahoria Zapallo

MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON TRANSFORMACIÓN GENÉTICA Transformación de Plantas Biobalística o Agrobacterium Mejoramiento Genético Resistencia a Patógenos Insectos Hongos Bacterias Resistencia a Herbicidas Esterilidad Sexual Roundup Materna Listo Paterna Calidad del Producto Color Postcosecha

Glifosato Bromoxinil

Asignacion • Definicion • • • Rescate de embriones Embriogénesis somática Organogénesis somática Producción de haploides Fusión de protoplastos Plasticidad Totipotencia Monocotiledodeas Dicotiledoneas