Biotechnologie fermentace Josef Trgl Modernizace vuky technickch a

Biotechnologie – fermentace Josef Trögl Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí 1

Získávání energie 1. Dýchání (respirace) – oxidace jedné látky jinou látkou za uvolnění energie Kvašení (fermentace) – rozklad jedné látky na energeticky chudší látky Fototrofie – využití světelné energie 2. 3. • Fotosyntéza = využití světla k syntéze organických látek Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Kvašení (fermentace) Substrát odpad + energie • • • Sacharidy Aminokyseliny Puriny Organické kyseliny … Odpad CO 2, ethanol, k. mléčná, k. propionová, aceton, butanol … Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Fermentace • fermentace je obecně nejméně výhodný proces pro získávání energie - málo energie - hodně odpadu + potřeba mála enzymů • př. : odbourávání glukózy – aerobní respirace – až 38 ATP – anaerobní respirace – cca 20 ATP – ethanolové kvašení – 2 ATP (kvasinky), 1 ATP (bakterie Zymomonas) Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Fermentace • podle starší terminologie se tak nazývala řada dalších mikrobiálních procesů – obecně jakýkoliv proces vyžadující kultivaci MO (odtud např. fermentor) – aerobní oxidativní procesy (octové kvašení – částečná oxidace sacharidů na kys. octovou) – anaerobní respirační procesy Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Obecná charakteristika fermentací • probíhají za anaerobních podmínek • tvorba ATP se uskutečňuje substrátovou fosforylací =fosfát se připojuje při některé z běžných reakcí (X při respiraci membránová fosforylace) • není potřebný exogenní akceptor vodíků a elektronů • NADH + H+ se přenosem vodíků na organickou látku reoxiduje na NAD+ - hlavní metabolický smysl fermentací • organická redukovaná látka je během katabolismu štěpena na dvě látky v ekvimolárním poměru – – – = později v metabolismu to může být i na víc jedna funguje jako donor vodíku (je oxidována) druhá funguje jako akceptor vodíku (je redukována) disproporcionace Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí 6

Obecná charakteristika fermentací • komplexní děj – vzniká celá řada produktů v závislosti na: – – – použitém substrátu p. H a jeho změnách během fermentace přítomnosti anorganických iontů přítomnosti organických růstových faktorů odstraňování produktů (narušování rovnováhy) … • označení typu fermentace dle dominantního produktu Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí 7

Fermentující mikroorganismy • Anaerobní děj – anaerobní organismy – fakultativně anaerobní – přepínají metabolismus z aerobního na anaerobní dle dostupnosti kyslíku – obvykle preference aerobního metabolismu (kvasinky) – obligátně anaerobní – kyslík jim obvykle škodí (Clostridium) – mikroaerofilní – kyslík urychluje růst, ale metabolismus je stále anaerobní (Lactobacillus) • Regulační mechanismy – indukce, represe • Různé mikroorganismy mají různé fermentační metabolismy – jedinečné, geneticky dané Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí 8

Pasteurův efekt • Pozorován poprvé Louisem Pasteurem • Kvasinky v přítomnosti kyslíku rostou rychleji a zpomalují kvašení • Vysvětlení: aerobní metabolismus glukózy uvolňuje 19 x více energie než anaerobní • Praktické aplikace – alkoholové kvašení je prováděno za anaerobních podmínek – produkce kvasnic je prováděna za aerobních podmínek Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Technologické provedení fermentací • Nutnost hlídat anaerobní (anoxické) prostředí – aerobní prostředí = s kyslíkem (> 0, 5 mg/l rozp. O 2) – anaerobní = bez kyslíku (~0 mg/l rozp. O 2) – anoxické = prostředí s nízkou koncentrací kyslíku (< 0, 5 mg/l rozp. O 2), někdy se uvažuje přítomnost anaerobních oxidovadel (dusičnany, sírany…) – často nemíchané provozy (zvyšovalo by to něžádoucí přestup O 2) – výjimečně probublávání N 2 (drahé) • Submerzní (častěji) i emerzní • Vsádkové i kontinuální (modernější, výkonnější, náročnější na regulaci) Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí 10

Technologické provedení fermentací • Udržování optimálních podmínek (t, p. H…) • Odstraňování produktů – posun rovnováhy ve prospěch produktů větší výtěžky – neutralizace kyselin Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí 11

Výchozí substráty při fermentacích • polysacharidy (škrob, glykogen, celulosa, chitin) – musí být nejprve hydrolyticky nebo fosforolyticky štěpeny na monosacharidy, které jsou fermentovatelné (zkvasitelné) • disacharidy (sacharosa, laktosa, maltosa) – nejprve štěpení • • monosacharidy-hexosy (glukosa, fruktosa, galaktosa) monosacharidy – pentosy (arabinosa, xylosa, ribosa) cukerné kyseliny – kyselina glukonová, galakturonová polyalkoholy – glycerol, mannitol Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí 12

Produkty fermentací • monokarboxylové kyseliny s 1 -4 C (mravenčí, octová, propionová, máselná) • hydroxykyseliny (mléčná) • dikarboxylové kyseliny (jantarová , glutarová) • alkoholy - ethanol, isopropanol, butanol, 2, 3 -butandiol • ketony – aceton • plynné produkty – rozkladem kyseliny mravenčí vzniká směs CO 2 a H 2 Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí 13

Alkoholové kvašení • • Glukóza 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 Zejména u kvasinek (Saccharomyces…) ale i u některých bakterií (Zymomonas) • Kvasinky – – – glykolýza glukózy na pyruvát dekarboxylace pyruvátu na acetaldehyd (pyruvátdekarboxyláza) redukce acetaldehydu na ethanol za oxidace NADH na NAD+ (alkoholdehydrogenáza) Organismus získá 2 ATP – • • = 5% teoretického maxima 30% energie reakce (zbytek je teplo) Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Alkoholové kvašení • Bakterie – Entner-Doudoroffova dráha – – – – Alternativní dráha metabolismu glukózy u některých bakterií Kombinace glykolýzy a pentózového cyklu Glc-6 -P oxidace na 6 -P-glukonolakton hydrolýza na kys. 2 -keto-3 -deoxy-6 -fosfoglukonovou dehydratace na 2 -keto-3 -deoxyfosfoglukonát štěpení na triózy (glyceraldehyd-3 -fosfát a pyruvát) glyceraldehyd se převede glykolýzou na pyruvát – – Dekarboxylace pyruvátu na acetaldehyd (pyruvátdekarboxyláza) Redukce acetaldehydu na ethanol za oxidace NADH na NAD+ (alkoholdehydrogenáza) Organismus získá 1 ATP – • = 2, 6% teoretického maxima

Alkoholové kvašení • • • Nejstarší a nejvýnosnější biotechnologický proces Spontánní mikrobní rozklady (kvašení ovocných šťáv…) Výroba alkoholických nápojů Lékařský ethanol Produkce bioethanolu Kynutí těsta – hlavní produkt CO 2 (ethanol se vypaří) Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Produkce alkoholických nápojů • Nejčastěji kvasinky, zejména Saccharomyces cerevisiae (kvasinka pivní) Kvašení cukr ethanol + CO 2 Různé druhy kvašení • • – – horní (emerzní)– méně používané, MO na hladině – tradiční piva (Belgie) spodní (submerzní) – MO na dně Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Produkce alkoholických nápojů • Kvašením může vzniknout max. cca 15 -20% alkoholu (cca vnitrobuněčná koncentrace ethanolu – zastavení kvašení = chemická rovnováha) – nápoje s vyšším obsahem alkoholu se buď destilují nebo míchají z čistého Et. OH Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Pivo • Slad – – – • zdroj sacharidů pro kvašení rmutování = postupné zahřívání sladu, štěpení škrobu amylázami na maltózu eventuálně karamelizace – tmavá piva Chmelové látky – – – • původně jako konzervovadlo zdroj hořké chuti dnes přidáván obvykle chmelový extrakt Voda – – vliv na chuť obvykle z pivovarských studní Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Kvašení piva • • 7 -14 dní, 8 -11°C Maltóza je zkvašena na Et. OH a CO 2 – – • • Vsádkové kvašení (kádě) Kontinuální kvašení (trubky) Oddělení kvasnic Zrání piva (20 -60 dnů) – – dokvašování chemické reakce s vlivem na chuť Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Víno • • Kvašený nápoj z vinného moštu Kvašení sacharóza Et. OH + CO 2 – • • Saccharomyces cerevisiae Podle cukernatosti hroznů zůstane část cukru nezkvašena – dělení vín na suchá až sladká Barva závisí na odrůdě a technice lisování Šumivá vína – druhotné kvašení - CO 2 se nenechá unikat (v láhvi nebo tanku) Perlivá vína – sycená CO 2 (bez druhotného kvašení) Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Bioethanol • Potenciální náhrada benzínu – – – • do 20% je možné neomezené přidávání do benzínu přes 20% potřeba přeřídit motory nižší výhřevnost – vyšší spotřeba Produkce ze sacharidů – – – sacharóza – nejjednodušší kvašení, ale drahá, v Brazílii škrob – jednoduché kvašení, ale drahý, v EU včetně ČR celulóza – obtížné kvašení, levná a dostupná, nepropracované technologie Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Sacharóza • • V Brazílii se jezdí až na 100% Et. OH Levný řepný cukr Vývoz Et. OH Vypalování pralesů kvůli plantážím třtiny Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Škrob • • • Přebytky zemědělství (EU) Jednoduchá technologie – rozklad, kvašení Drahá surovina – – – • Mnohdy až pasivní bilance energie (na litr Et. OH se spotřebuje více nafty) – • • zemědělství má vysokou spotřebu energie příliš mnoho dopravy suroviny potenciál genetických modifikací potřeba optimalizace Zdražování potravin Devastace půdy nevhodnými plodinami (kukuřice) Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Celulóza • • • Nejrozšířenější a nejlevnější (dřevo) Možnost využít odpad (piliny, starý papír…) Obtížná technologie – – – celulóza je krystalická – obtížný rozklad na monosacharidy doprovázena ligninem a hemicelulózami – obtížné oddělení komplexu hemicelulóy obsahují i kyselé cukry – inhibice kvašení Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Celulóza • Technologie dosud ve stádiích experimentů – potenciál zefektivnění Rozklad dřeva napařováním, máčením v horké H 2 SO 4. . Biologický potenciál • • – – – dřevokazné houby – rozklad ligninu (ale konzumují celulózu) některé bakterie mají celulolytické enzymy (ale neumí rozložit lignin) konstrukce GMO Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Mléčné kvašení • • =laktátová fermentace Tzv. mléčné bakterie (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus…) – – • anaerobní mikroaerofilní hlavní produkt kyselina mléčná (laktát) OH COOH Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Homofermentativní mléčné kvašení • • Glukóza 2 kyselina mléčná Nejjednodušší fermentace Glykolýza Redukce pyruvátu na mléčnou kyselinu, reoxidace NADH • Enzym laktátdehydrogenáza OH O COOH + NADH + H+ + NAD+ Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Homofermentativní mléčné kvašení • homofermentativní mléčné bakterie (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus…) Většinou neobsahují cytochromy – nemají respirační dráhy Většina umí využít laktózu Častá absence řady anabolických drah náročné na výživu a růstové substráty • • • – – – vitamíny zdroje N … Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Heterofermentativní mléčné kvašení • • Glc kyselina mléčná + ethanol + CO 2 Anaerobní mléčné bakterie, kterým chybí enzym aldoláza – „metabolická objížďka“ pomocí enzymů pentózového cyklu – • • tzv. fosfoketolázová dráha Leuconostoc, Oenococcus, některé laktobacily Nízké biotechnologické využití Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Využití mléčného kvašení • Mlékárenský průmysl – – • produkce jogurtů kysané mléčné výrobky (podmáslí, kefíry…) Ostatní potravinářský průmysl – – • fermentované (trvanlivé) salámy kysané zelí a jiná zelenina – konzervační účinky kysl. mléčné Zemědělství – • silážování Průmyslová výroba kyseliny mléčné – neutralizace Ca. CO 3 – posun rovnováhy Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Využití mléčného kvašení • Zdravotnictví – – probiotické produkty s pozitivním zdravotním účinkem mléčné bakterie jsou dominantní vaginální mikroflórou • • – – – zkvašují sacharidy poševního sekretu vznik kyselého prostředí ochrana proti patogenním MO – adaptované obvykle na p. H 7 laktobacilové kapsle pro obnovu vaginální mikroflóry lubrikační gely … Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Výroba jogurtů • jogurt = výrobek, který vznikl prokysáním mléka, smetany nebo podmáslí či jejich směsí jogurtovou kulturou v den data spotřeby musí být min koncentrace živých jogurtových kultur 107 CFU/g • – běžně bývá i 100 x více Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Výroba jogurtů • • výchozí surovina = pasterizované mléko zaočkování jogurtovou kulturou – – – • Lactobacillus delbrueckii (bulgaricus) Streptococcus salivarius thermophikus Bifidobacterium kultivace při 40°C – – v kelímku v tanku Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Clostridiové kvašení • • bakterie rodu Clostridium Glc – – – – • H 2 CO 2 k. octová aceton 2 -propanol k. 2 -hydroxymáselná k. máselná 1 -butanol Komplexní metabolismus výchozí z Ac-SCo. A Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Clostridiové kvašení Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Clostridiové kvašení • • podle druhu Clostridium převažuje jeden produkt C. butyricum - kys. máselná (butyrát) – – • • • kys. máselná silně zapáchá, ale její estery jsou vonné – přísady do voňavek přídavky Ca. CO 3 – neutralizace, posun rovnováhy C. butylicum – butanol – rozpouštědlo C. acetobutylicum – aceton – rozpouštědlo Produkce plynů (H 2, CO 2) – snaha o výrobu – nežádoucí v sýrařství Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Kvašení střevních bakterií • • • Smíšená kyselinotvorná fermentace Glc Et. OH + k. octová + k. mravenčí + minoritní kyseliny Část kyseliny mravenčí (formiátu) se rozkládá na CO 2 + H 2 – • • enzym hydrogenlyasa Escherichia coli, Enterobacter, Salmonella, některé rody Bacillus CO 2 a H 2 využijí methanogenní archea Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Kvašení střevních bakterií Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Propionové kvašení • • Glc kys. propionová + kys. octová + CO 2 Propionicbacterium Využití reakcí citrátového cyklu (obráceně) Propionát vápenatý – protiplísňový prostředek (papír, obaly…) Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí

Propionové kvašení Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí