Bioqumica Experimental E coli para la clonacin de

Bioquímica Experimental E. coli para la clonación de DNA y expresión de proteína recombinante. Semestre 2015 -II 17 de marzo de 2015

Nomenclatura Por convención en el genotipo solo se indican los genes mutantes, sin embargo los símbolos “-” y “+” (superíndice) se usan redundantemente para enfatizar un locus silvestre. • Los Fenotipos se indican en mayúscula y son seguidos por un superíndice “+” o “-”, y algunas veces “r” (resistente) o “s” (sensible) Mutación en el gen que codifica para la proteína ribosomal S 12. rps. L (Strr) Resistencia a estreptomicina. • Mutación en un locus conocido o desconocido hsd. R 17 Mutación lugar específica arg-3 Se desconoce el locus exacto

Nomenclatura • Una mutación amber es indicada como am y una mutación sensible a la temperatura se denota como ts. • Una mutación constitutiva se indica con un superíndice q lac. Iq Expresión constitutiva del gen que codifica para el represor lac. • Las deleciones son indicadas con Δ Δ (lac-pro) Los genes entre lac y pro también están deletados. • Las inserciones se indican con : : trp. C 22: : Tn 10 Sitio de la inserción DNA insertado

Nomenclatura La posición de la inserción en el mapa se puede indicar por un código de tres letras. Thus, zgh: : Tn 10 Siempre es z Intervalos de 1 minuto Intervalos de 10 minutos (letras a-i) Una fusión se indica con el símbolo Φ seguido de los genes fusionados dentro de un paréntesis. Deleción en 3’ Indica un operon Φ (omp. C’-lac. Z+) F+, y Hfr son indicados al principio del genotipo, si la cepa es F’ entonces esto es indicado al final del genotipo con los genes llevados por el plásmido F listados en corchetes. Plásmidos y fagos lisogénicos llevados por la cepa, son mencionados en paréntesis al final del genotipo.

Propiedades generales de los hospederos para clonación 1. - Auxotrofia 2. - Mutaciones supresoras: Existen vectores que contienen mutaciones sin sentido en genes esenciales como medida preventiva para evitar su propagación a poblaciones naturales de bacterias. 3. - Sistemas de restricción modificación: Previene el intercambio genético entre grupos de bacterias permitiendo al hospedero reconocer y destruir DNA foráneo.

Propiedades generales de los hospederos para clonación 3. 1. 1. - Metilación Dam y Dcm. GATC CC(A/T)GG La mayoría de cepas usadas para clonación son Dam+ y Dcm+. Cepas que son rec. A-, siempre son dam+ El genotipo rec. A- dam- es letal.

Propiedades generales de los hospederos para clonación • La presencia de Dam o Dcm puede afectar la eficiencia de transformación para un plásmido. DNAmet E. Coli dam- • Las cepas con mutaciones en Dam- Dcm son mutagénicas. 3. 1. 2. - Sistema Eco. K • Modifica el residuo de adenina (AACN 6 GTGC) • Esta codificado por el locus hsd. RMS (hsd. R codifica para la nucleasa, hsd. M codifica para la metilasa y hsd. S la subunidad de reconocimiento) • Cepas utilizadas para clonación generalmente son hsd. R- (r. K- m. K+) o hsd. S(r. K- m. K-) Ventaja: Transformación eficiente de DNA generado por PCR

Propiedades generales de los hospederos para clonación 3. 1. 2. - Sistemas de restricción dependientes de metilación Mcr. A, Mcr. BC, y Mrr. • Mcr. A y Mcr. BC cortan metilcitocinas en las secuencias CG y (A/C)G respectivamente, Mrr corta metiladeninas. • Mcr. A-, Mcr. BC-, o Mrr-. Ventaja: Permite la clonación de DNA altamente metilado 4. - Recombinación • Los sistemas de recombinación del hospedero pueden catalizar el rearreglo del DNA recombinante. • Mutaciones en el hospedero que suprimen la recombinación, pueden ayudar a mantener la integridad del DNA clonado Rec. AVentaja: Incrementa la estabilidad del DNA plasmídico.

Propiedades generales de los hospederos para clonación 5. - α-complementación; Δ(lac-pro. AB) complementado con lac. ZΔM 15 presente en el profago Φ 80 o el plásmido ´F’

Hospederos para clonación end. A 1: mutación en una endonucleasa inespecífica Ventaja: Mejora el rendimiento y la calidad del plásmido obtenido. gal E: Bloquea la producción de UDP glucosa, esto provoca que los lipopolisacáridos de membrana estén truncos, lo cual facilita la entrada de DNA. TOP 10= DH 10 B+ Resistencia a estreptomicina

Propiedades generales de los hospederos para expresión 1. - Represores • Los promotores, lac. UV 5 y tac (comúnmente utilizados para regular la expresión en el vector) requieren al represor lac. Iq. Plásmidos con alto número de copia requieren que lac. Iq sea suplido en trans en un plásmido compatible. • lac. Y: Previene el transporte activo de IPTG Ventaja: El IPTG entra a la célula dependiendo de su concentración; la proteína recombinante se expresa uniformemente en todas las células. • Sistema basado en la RNApol T 7 La síntesis de la RNApol es regulada por el promotor lac. UV 5 (inducible por IPTG), ésta se encuentra en trans del lisógeno λ(DE 3). Plásmidos p. Lys. S o p. Lys. E, expresan la lizosima T 7 Ventaja: Control muy astringente de la expresión (Proteínas tóxicas)

Propiedades generales de los hospederos para expresión 2. - Estabilidad • Proteasas Ion: mutación en la secuencia que Codifica para la proteasa mayoritaria dependiente de ATP en E. coli. rpo. H: disminuye la velocidad con que se degradan las proteínas Omp. T: Deficiencia de una proteasa de la membrana externa Ventaja: Purificación de proteína recombinante intacta • RNAsa rne: abate la actividad de la RNAsa E Ventaja: Incrementa la disponibilidad de m. RNA para la traducción

Propiedades generales de los hospederos para expresión 3. - Uso de codones • La frecuencia de utilización de codones varia entre organismos; los genes que contienen una alta proporción de codones raros casi no son expresados. • Existen cepas de E. coli que contienen plásmidos con copias extras de t. RNAs raros, particularmente arg. U (AGA/AGG), ile. Y (AUA), gly. T (GGA), leu. W (CUA), y pro. L (CCC) Ventaja: Permiten la expresión de genes provenientes de genomas ricos AT o GC. 4. - Solubilidad Dna. K-Dna. J y Gro. ES-Gro. EL ayudan a E. coli (silvestre) a plegar proteínas correctamente; existe evidencia que la co-sobrexpresión aumenta la proporción de proteína soluble. trx. B y gor (los cuales codifican para una tioredoxina y glutatión reductasa respectivamente) facilitan la formación de puentes disulfuro. Ventaja: Útiles cuando la producción de proteína soluble depende de una oxidación adecuada.

Hospederos para expresión

Referencia Methods in Molecular Biology, Vol. 235: E. coli Plasmid Vectors Edited by: N. Casali and A. Preston © Humana Press Inc. , Totowa, NJ