BIOPROCESSING BIOFELDOLGOZS Ipari biotechnolgia kulcslpsei 1 Upstream processing
BIOPROCESSING „BIO-FELDOLGOZÁS”
Ipari biotechnológia kulcslépései 1. Upstream processing: a nyersanyag előkészítése a fermentációra, vagy transzformációra 2. Fermentáció, transzformáció: bioreaktorokban sejtszaporítás, antibiotikum, fehérje, stb. előállítás 3. Downstream processing: a kívánt termék tisztítása, kiszerelése Nyersanyag előkészítés Fermentáció, biotranszformáció termék kinyerés, kiszerelés Termék
1. Upstream - bioreaktorok - tápanyagok - sterilizálás - oxigénellátás - aerob/anaerob fermentálás 2. Downstream - sejt izolálás - feltárás - extrakció - fehérje tisztítás - kiszerelés - melléktermékek, hulladék kezelés
Fermentáció • A gyógyszer-, élelmiszer-, és vegyiparban használt (bio-) termékek előállításában a mikrobiális fermentációknak nagy jelentőségük van • Fermentáció hatékonysága sajnos gyakran elmarad a teoretikus maximumtól • Mikroba fiziológia • Rekombináns sejtekkel történő fermentációk • Mikrobiális konverziók – fermentáció • Enzimatikus folyamatokon alapuló konverzió – biokonverzió • Fermentor– reaktor, melyet mikrobiális konverziókra haszn.
Fermentációs eljárások típusai Nyílt és zárt rendszerek • Szakaszos fermentáció (Batch) – a reaktánsokat (tápanyagok, sejtinokulum, gázok – folyamatos levegőztetés) együtt visszük a rdsz-be a fermentáció megkezdése előtt – alapvetően zárt rdsz – térfogat állandó – Egyszerű eljárás, de termékgátlás ill. szubsztrát gátlás lehetséges • Rátáplálásos szakaszos fermentáció (Fed-batch) – a tápanyagokat folyamatosan adagoljuk (szubsztrát gátlás elkerülése) – a térfogat nő, mert nincs elvezetés • Folytonos fermentáció (continuous) – nyitott rdsz – amennyi tápanyagot bejuttatunk, annyi térfogatnyit el is veszünk – paraméterek állandóak • Félfolytonos fermentáció (semicontinuous) – szakaszos fermentációk sorozata, melyben a fermentlé kb 10%-át a fermentorban hagyjuk, és ehhez adjuk a friss tápanyagokat
bioreaktorok • Központi szerep, a bioreakciók helyszíne • Fontos a sejt kinetika, anyagtranszfer, folyadék keveredés a bioreaktor tervezéshez • Bioreaktor – hardware és software szabályozás, a mikroorg. számára fontos környezeti faktorok szinten tarthatók – Kultúra paraméterei: hőmérséklet, keverési sebesség, nyomás, gázáram, p. H, p. O 2, esetleg p. CO 2, hígulás mértéke – Nagy felbontású (elsősorban laboratóriumi, az optimalizáláshoz) bioreaktorokba lehet on-line optikai denzitás mérés, szubsztrát konc. meghat.
Bioreaktor konfigurációk A bioreaktor (fermentor) egy edény, melyben a biológiai reakciókat kivitelezzük: • mikroorganizmus szaporítása, enzim- vagy immobilizált sejtes reakciók, szövettenyészetek • méret: 0, 5 -2 000 l • üveg-rozsdamentes acél, esetleg műanyag • Alapvető paraméterek nyomonkövethetők • Mintavételezési lehetőség • Kevertetés -nyíróerők
Bioreaktor konfigurációk 1. Görgetett edény • Ált. műanyagból • Horizontális kialakítású, lassú keveréssel • Megfelelő levegőztetés, anyageloszlás érhető el • A sejtek a henger belső felszínéhez tapadva szaporodnak, nem lepi el folyamatosan a tápoldat • A töltet a henger térf. max 30%-a lehet • Olcsó, de a kontroll, és monitor nem hatékony Szabályozó egység Bioreaktor edény Görgető rendszer
Bioreaktor konfigurációk 2. Kevertetett tank bioreaktorok • Leggyakrabban használt típus • Mechanikus keverő rdsz-rel ellátott • Rozsdamentes acél (kisebb térf-nál lehet üveg) • Magasság: átmérő arány (1: 1, 3: 1) • Keverés keverőlapátokkal, azok kialakítása a nyíróerők szempontjából fontos • Levegőztetés megoldása • Sejtek denzitása ált. 106 -107 sejt/ml, de ez javítható akár több nagyságrenddel is • Mérete akármeddig nem növelhető a keverés, oxigénellátás, hőmérséklet tartás miatt Kevert tankreaktor (angol: stirred tank bioreactor ‘STB’)
Bioreaktor konfigurációk távozógáz 3. Air-lift bioreaktorok • Egyszerű, olcsó • A reaktor belsejében egy központi cső, un. emelő (riser), és egy külső hengeres gyűrű un. levezetőcső (downcomer) • Fertőzés veszély is csökken • Sejtek denzitása ált. 106 sejt/ml Gáz buborék Belső cső elem a gáz áramlás biztosítására áramlásmérő Gáz elosztó Gáz beinjektálása
Bioreaktor konfigurációk 4. Fluid-ágyas bioreaktor • • • Hordozó, sejtaggretátok, kisebb térfogat (max 100 L) nagy sejtmennyiséggel – szuszpendált és kitapadó sejtek is Transzport folyamatok - nem elég hatékony • • • Fejlesztés kollagén mikrohordozóval jó eredmények Reciklizáló cső Sejtek denzitása ált. 108 sejt/ml
Bioreaktor konfigurációk 5. Üreges szálas-bioreaktorok • • • Egyszerű, de max néhány liter Kapilláris szálak egy henger testben, mindkét végén tapadnak A sejtek a kapillárisok közötti térben szaporodnak (szövetszerű) Főleg humán sejtkultúrák számára Sejtek denzitása 108 sejt/ml Termék visz. tisztán nyerhető
Bioreaktor konfigurációk 7. Fix ágyas bioreaktorok • A sejtek hordozóhoz (pl. aktív szén) kötötten, vagy polimerbe csomagoltan • Fluid ágyassal szemben előny a stabilitás • Hátránya, hogy a transzport folyamatok mértéke kisebb, grádiens alakulhat ki a bioreaktorban (nem lesz homogén a rdsz) • Sejtek denzitása ált. 106 -107 sejt/ml • Termék kinyerése nehézkesebb 1. • • • Kerámia ágyas bioreaktorok Kerámia hordozó, újrahasználható, költséghatékony Jó minőség, hőmérséklet tolerancia Széles körű felhasználás Inhomogenitás lehet a reaktorban Sejtek denzitása ált. 107 -108 sejt/ml
keverés • Mechanikus propellerek segítségével • Levegő áramoltatás segítségével termék hőcserélő bioreaktor • Külső hurok/ forgatás segítségével
keverés • Feladata a megfelelő anyagtranszport fenntartása, azaz a beáramló levegő, a tápoldatban oldott (vagy nem oldott) tápanyagok, és a keletkező termékek egyenletes eloszlatása • Az egyes oldatok viszkozitása szintén befolyásolja a keverés módját, mértékét. Ez az időben változhat, egyrészt a szaporodó mikróbák, valamint a keletkező termék miatt. • A kevertetés mértéke akármeddig nem növelhető a nyíróerők miatt • A keverés sebességét és a levegőztetés sebességét egymást figyelembe véve kell optimalizálni (ne alakuljanak ki légüregek)
Propeller fajták
levegőztetés Eltérő oxigény • aerob/anaerob szaporítás • baktériumok/gombák • enzimes/sejtes folyamatok Oldott oxigén szint • oldhatóság mértéke hőmérséklet függő Buborék méret • túl nagy buborék – hiába juttatunk sok levegőt be, nem hasznosul • intenzív keveréssel lehet apró buborékokat nyerni • eleve apró buborékképzés pezsegtetés belső külső
oxigénellátás
tápközeg Szilárd v. folyékony Természetes, félszintetikus, szintetikus Tápanyagok: • Szén-, energiaforrás • Nitrogénforrás, egyéb ásványi anyagok • Mikroelemek • Vitaminok • Növekedési faktorok
Szén-, és energiaforrások Természetes: – melasz: a cukorgyártás mellékterméke. ~ 50% cukortartalom, de emellett jelentős nitrogénforrás is – sajt/tej permeátum: 6 -7% szárazanyagtartalom, főleg laktóz, kevés zsír, fehérje, ásványianyagok – Magáztató folyadék (corn steep liquor-CSL): a magok nedves őrlése során keletkezik, cukrok és kismolekulasúlyú N tartalmú vegyületek – Manióka v. cassava: 20 -40% keményítő, kevés fehérje, zsír – Bagasse: cukornádból a cukor kinyerése után visszamaradó rostos anyag
Szén-, és energiaforrások Drágább, de természetes alapú alapanyagok: – húskivonat: fehérjéket, aminosavakat tartalmaz. Húsleves bepárlásával állítják elő. Lekvárszerű illetve por alakú – pepton: fehérjék savas vagy enzimatikus hidrolízisével állítják elő. Vízben könnyen oldódik. A fehérjék tripszines lebontásával (mely egészen az aminosavakig megy) keletkező magas triptofán tartalmú pepton a Trypton – Élesztőkivonat Pontos összetételük nem mindig ismert, változhat, ezért pl. laborban a kísérletek kivitelezése során inkább jól definiált alapanyagokat használunk
Nitrogén források • Szervetlen: – nitrát sók, ammónium sók • Szerves – Kukoricalekvár: a kukoricaszem áztatása során keletkező áztatólé 50%-ra töményítve – Húskivonat – Pepton, tripton
egyebek • Szervetlen ionok: – Foszfor, kén, vas, nyomelemek • Növekedési faktorok: – melyekre a mikróbáknak szükségük van szaporodásukhoz, de szintetizálni nem tudják • Szelektív ágensek: – Specifikusak az adott mikrobára, másokra gátló hatásúak • Habzás gátlók – csökkentik a felületi feszültséget (a folyadék-gáz határfelületen), ennek következtében a légbuborékok átmérője kisebb lesz • Szelektív körülmények – Pl. szén-, nitrogén forrás limitáció- elősegítheti bizonyos anyagok intenzívebb termelődését, extracelluláris termékek képzése – Van elég szénforrás, de kevés a nitrogén forrás poliszaharid, PHA felhalmozás (akkumuláció) lehet
sterilezés (csíramentesítés) • Szennyező mikroorganizmusok elpusztítása a fermentáció előtt – Hőkezelés, sugárzás (UV, gamma), kémiai ágensek, ultrahang, szűrés – Hőkezelés gőzzel, ha nyomást is tudunk alkalmazni, jobb a hatékonyság, rövidebb idő elég (teszt organizmus Bacillus stearothermophilus) – Spórák elpusztítása érdekében néha többszörös sterilezés szükséges, ez azonban károsíthatja a tápanyagokat (pl. cukrok karamellizálódnak)
sterilezés (csíramentesítés) Tápoldat + gáz sterilezés Folyadék - szűrés/ülepítés - kémiai-, hő- inaktiválás 1. Szűréssel: - cellulóz alapú filterek, pórus átmérő igény szerint változó 0, 2 0, 45 mm 2. Inaktiválással: - hőkezelés: teszt mikróba: Bacillus stearothermophilus hőérzékeny tápkomponensek 3. Kémiai: hypo, formaldehid oxidálószerek (pl. H 2 O 2, peroxiecetsav)
sterilezés (csíramentesítés) Gáz - szűrés - UV, röntgen - kémiai Mi szennyez? : – penészgombák >> egyebek – fágok kiszűrése még ma sem megoldott Szűrés – filterek –hidrofób jelleg – formaldehiddel átitatott üveggyapot – kritikus sebesség/perc hatásfok igény: 0, 5 - 1, 5 térf. levegő/perc folyadék térfogatonként
Fermentációs termékek • Sejt pl. élesztő, SCP • Elsődleges metabolitok pl. citromsav, etanol, glutaminsav (ált. 200 000 L kevertetett tank fermentorokban) • Másodlagos metabolitok pl. antibiotikumok (ált. 50 000 – 200 000 L térfogatban) • Enzimek (főleg extracelluláris, pl. amilázok, proteázok, lipázok. 30 -220 m 3 térf) • Terápiás fehérjék pl. interferon, növekedési hormon, inzulin… • Vakcinák pl. hepatitis-, szamárköhögés ellen
termékkinyerés Centrifugálás, ülepítés, szűrés - sejtek összegyűjtése • Ha sejtalkotót, vagy intracelluláris terméket áll. elő szükséges a sejtek feltárása: – mechanikai: örlő malom, ultrahang, nyomás – kémiai: szerves oldószerek, detergensek – enzimatikus: lizozim (G+ baktériumokra, G- esetén SDS-sel együtt) • Extrakció, filtráció, adszorbció, kicsapás – Kis molekulák kinyerése pl. folyadék-folyadék extrakció • Oldószeres –hidrofób termék esetén • Detergens segítségével – Filtráció – szűrőn áteresztjük, dializis – Adszorbció - hordozóhoz kötjük a kinyerni kívánt anyagot – Kicsapás – csapadékot képzünk pl. magas sókonc-val (pl. ammónium-szulfátos) • Tisztítás – Kromatográfia (álló- és mozgó fázis) • Gélfiltráció • Elúciós kromatográfia (ioncserés, hidrofób, affinitás)
Sejtek összegyűjtése, koncentrálása centrifugálással
Sejtek feltárása ultrahang (1), detergens (2), nyomás (3), örlő malom (4) segítségével
Kromatográfiás folyamatok • Kromatográfia elválasztási módszer. • Kromatográfiában az állófázis (mely ált. porózus, nagy felülettel rendelk. anyag) és a mozgófázis (ált. folyadék vagy gáz) között megoszlanak az anyagok egyensúlyi állandójuk szerint. • A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a befecskendezési ponttól a detektorig (érzékelő berendezés) jut. • Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később távoznak, mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. • Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.
Kromatográfia - gélfiltráció • Molekula méret szerinti elválasztás • Töltet: porózus szemcsék – Természetes polimerek (pl. dextrán, agaróz) – Szintetikus polimerek (pl. poliakrilamid)
Kromatográfia - Hidrofób kromatográfia • Magas sókoncentráció mellett fehérjék képesek/hajlamosak poláros felszínhez kötődni • A sókonc. csökkentésével a fehérjék leválnak a hordozóról, eltérő sókonc-nál hidrofób tulajdonságuknak megfelelően
Kromatográfia - Affinitás kromatográfia • Gélágy ligandja specifikus affinitással bír az elválasztandó anyaghoz • Az adszorbeált termék leválasztása pl. sókoncentráció, p. H változtatás, vagy akár a ligandot az eluáló szerhez adjuk
Kromatográfia - Ioncserés kromatográfia • Erős kationcserélő oszlop: a negatív töltésű állófázison pozitív ionokat választunk el. • Erős anioncserélő oszlop: pozitív töltésű állófázison negatív ionokat választunk el. • Ioncserélő kapacitás függ az állófázison kötött töltések számától. • A termék leválasztására ellenionokat tart-ó eluenst haszn.
kiszerelés • Kristályosítás – A kristály - csak egyféle anyag alkothatja a kristályrácsot • Szárítás – ált. nagy felületen forró levegővel • Liofilizálás – hőérzékeny termékekre: vitaminok, enzimek, vakcinák, mikróbák, gyógyhatású fehérjék • Csomagolás • Hulladékkezelés
- Slides: 37