Biologie moderne des leucmies aigus myloblastiques LAM C

Biologie moderne des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) C. Preudhomme Laboratoire d’Hématologie A U 524 Inserm Lille

Introduction § 40 % des LAM : Anomalies cytogénétiques Ø Identification de gènes Ø Pronostic Ø Diagnostic et suivi Ø Physiopathologie Ø Modèle murin § 60 % des LAM : Identification d’autres mécanismes Identification d’autres gènes (analogie de fonction ou nouvelles technologies) § Ciblage thérapeutique moléculaire

2003 Impact pronostique des anomalies chromosomiques • Consensus international – Bon risque t(15; 17) t(8; 21) inv(16) – Mauvais risque -5/5 q- -7 3 q t(9; 22) t(6; 9) complexe – Intermédiaire caryo normal • Résultats contradictoires 11 q 23 trisomie 8 autres trisomies autres a. structure Reste à définir sur grandes séries prospectives

Distribution des anomalies chromosomiques varie avec l ’âge (St Jude -Schoch) <2 ans enfants Adult <60 ans Adult >60 ans t(8; 21) 0% 14% 8% 2% inv(16) 5% 6% 5% 3% t(15; 17) 0% 8% 6% 3% t(9; 11) 18% 6% 2% 41% 9% autres 11 q 23 23% 3% 5, 3% 0, 8% Normal 10% 20% 40% Complex - < 10% 15% 30%

MRC 10 t(8; 21) t(15; 17) inv(16) normal • anomalies isolées • associées à risque intermédiaire • associées à mauvais risque

Caryotype complexe Basé sur résultats caryotype (cytogénétique conventionnelle) Définition variable MRC >=5 anomalies EORTC/GIMENA >=4 anomalies Autres groupes >=3 anomalies Fréquence augmente avec âge enfant <10% adulte 8 -10% >60 ans 18 -30%

Que contient un caryotype complexe ? Schoch GCC 2002; 35: 20 Pertes >>>> gains -5/5 q-7/7 q- souvent combinées (24% : les 3 délétions) 17 p 18 q-, 12 p- … moins fréquents 15%-20% des cas : absence d’anomalie 5/ 7/ 17

Impact pronostique du caryotype complexe MRC 10 15 -56 ans MRC 11 s. âgés

German AML cooperative group retrouve le mauvais pronostic >=3 anomalies chez <60 ans et > 60 ans Schoch BJH 2001; 112: 118

Les 11 q 23/MLL LAM enfant Distinction t(9; 11)(p 21; q 23) et les autres 11 q 23/MLL St Jude JCO 2002; 20: 2302

Les 11 q 23/MLL LAM adulte MRC • MRC 10 1998: tous 11 q 23/MLL dans groupe intermédiaire • ASH 2002: tous 11 q 23/MLL restent dans groupe intermédiaire CALGB • t(9; 11) dans groupe intermédiaire • autres 11 q 23 dans groupe mauvais pronostic SWOG • tous les 11 q en mauvais pronostic BGMT 95 • 11 q 23/MLL autres que t(9; 11) mauvais pronostic

Les 11 q 23/MLL Seul screening FISH systématique recommandé (arbre décisionnel LAM) FISH double couleur • cellules interphasiques=southern (sauf ITD MLL) • cellules métaphasiques: identification partenaire Répertorier tous les partenaires MLL Déterminer le pronostic de chaque translocation

AML 1 SCL

Les Core binding Factor : 3 sous unités et une seule Gènes Fonction principale AML 1 RUNX 1/CBFA 2/PEBP 2 a. B Hématopoïèse AML 2 RUNX 3/CBFA 3/PEBP 2 a. C ossification AML 3 RUNX 2/CBFA 1/PEBP 2 a. A Développement tractus gastro-intestinal 1 domaine en commun : le domaine RUNT

Le domaine Runt • Forte homologie avec le gène runt de la drosophile • 128 AA très conservés CBF Runt • domaine Ig-like, semblable à p 53, NF- B, STATs • Fixation à l’ADN et association avec CBF • Reconnaissance d’un motif Py. GGTPy R 80 R 174 R 177 « Wing » A’-B « Tail » ADN

Fonctions de AML 1 • Rôle pivot dans l’hématopoïèse : souris KO aml 1 -/- non viables • Fonction: Régulation de la croissance et de la différenciation des granulocytes • Contrôle l’expression de nombreux gènes : IL 3, récepteur M-CSF, myéloperoxydase (MPO)… chaînes , , et du TCR (T Cell Receptor) inhibiteur de kinase cycline-dépendante p 21 WAF 1

Effet activateur + Acetylation CREB LEF-1 Ac P 300 / CBP ALY P-CAF Ac RUNX 1 CEBP RHD MPO IL 3 GM-CSF R TCR PU. 1 Ac c-MYB CBF Effet inhibiteur Fixation répresseur TLE m. Sin 3 A EAR 2 RHD NLS TAD 453 VWRPY NM 381 Liaison à la matrice nucléaire co-localisation avec la RNA pol 351 - P 21 WAF et autres. . .

Altération par translocations Différents partenaires Core Binding Factor (CBF) fréquemment réarrangé dans leucémies * t(8; 21)(q 22; q 22) t(12; 21)(p 12; q 22) t(16; 21)(q 24; q 22) t(8; 21)(q 24; q 22) t(3; 21)(q 26; q 22) * AML 1 -ETO (MTG 8) LAM TEL-AML 1 (AML 1 -ETV 6) LAL AML 1 -MTG 16 LAM AML 1 -ETO 2 (TRPS 1) LAM AML 1 -EVI 1, AML 1 -MDS 1, AML 1 -EAP LMC, SMD t(19; 21)(q 13; q 22) AML 1 -AMP 19 LAM inv 16(p 13; q 22) CBFb -MYH 11 LAM

Altération par translocations Conséquences fonctionnelles ETO N-Co. R Déacétylation, répression ETO MTGR 1 ETO 2 MTG 16 m. Sin 3 A HDAC Bcl 2 M-CSF R AML 1 RHD GM-CSF TCR TGF CEBP

T(8, 21) et INV(16) • Cytogénétique • FISH ou RQPCR si echec de caryo t(8; 21) et M 1/M 2/M 4 idem+normal si inv(16)

Mutations constitutionnelles de aml 1 Familial Platelet Disorder (FPD) prédisposition LAM altération = délétion, mutations faux-sens ou non-sens haploinsuffisance : Song et al. Nat. Genet. 2000

Mutations acquises et hémopathies malignes (1) ~6, 5% dans les HM (> 900 patients) 20 -25% dans les LAM 0 (34/142) Osato et al. Blood 1999 Yeoh et al. ASH 2000 Preudhomme et al. Blood 2000 Langabaer et al. GCC 2002 35% dans les HM associées à Tri 21 acquises 30 -40% dans les SMD secondaires (radiothérapie, chimiothérapie)

C/EBP (1) La protéine C/EBP Facteur de transcription indispensable à la différenciation myéloïde. Fixation sur les régions promotrices du G-CSF R, GM-CSF R, MPO, . . .

C/EBP (2) • Protéine C/EBP Coopération avec d ’autres facteurs AML 1, CBF , PU-1. . .

C/EBP (4) • Protéine C/EBP • 2 domaines de transactivation • 1 domaine ZIP : Liaison au DNA Dimérisation • 2 ATG d ’initiation Protéines de 42 ou de 30 k. D. 30 Kd 42 Kd TAD 1 TAD 2 b. ZIP • Effet dominant négatif de la 30 k. D.

LAM et mutations de CEBPA (3) • Pabst et al, Nature Genetics, vol 27, March 2001 7 % mutations (10/137) dans les LAM. 16% (5/30) dans les LAM 2 sans t(8/21). • Gombart et al, Blood, vol 99, February 2002 408 échantillons de tumeurs toutes confondues. 11 patients mutés: 8/78 LAM 1/92 SMD (1 AREB-T) 1/36 cancer pulmonaire à petites cellules. 1/33 cancer de la prostate

Descriptif des Mutations de CEBPA 70 97 TAD 1 127 200 TAD 2 159 278 b. ZIP 358 Wild type Patients 1, 8, 11 1 er groupe: Mutants N-Ter Patients 2, 9 Patient 3 107 Patients 4, 6, 12 Patient 5 Patient 10 59 Patient 7 TAD 2 b. ZIP Forme de 30 k. D: Patients 1 à 12 • 42 k. D tronquée • 30 k. D Dominant négatif

Descriptif des Mutations de CEBPA 70 97 TAD 1 127 200 TAD 2 278 b. ZIP 358 Wild type 2ème groupe: Mutants C-Ter Patient 7, 9, 10, 11, 14, 15 Patient 15 383 Patient 8 70 97 TAD 1 127 200 TAD 2 278 b. ZIP 358 Wild type 313 Patient 12, 13 Fixation au DNA ou dimérisation altérée 3ème groupe: partie centrale Domaine b. ZIP amputé

C/EBP : survie globale CEBP Muté CEBP WT C/EBP muté = amélioration de la survie globale P=0. 03

C/EBP A dominant-negative mutant of C/EBP, associated with acute myeloid leukemias, inhibits differentiation of myeloid and erythroid progenitors of man but not mouse Maike Schwieger, Jürgen Löhler, Meike Fischer, Uwe Herwig, Daniel G. Tenen and Carol Stocking Blood, 1 April 2004, Vol. 103, No. 7, pp. 2744 -2752. C/EBPp 30, a myeloid leukemia oncoprotein, limits G-CSF receptor expression but not terminal granulopoiesis via site-selective inhibition of C/EBP DNA binding Rebecca Cleaves, Qian-fei Wang and Alan D Friedman 1 Blood. 2004 Apr 1; 103(7): 2744 -52. Epub 2003 Dec 04.

Altération par translocations AML 1 -ETO et leucemogénèse : nécessaire et/ou suffisant ? (1) MRD+ chez les patients en longue RC Miyamoto et al. PNAS 2000 HSC: cellules souches; CLP: progéniteurs lymphoides

Altération par translocations AML 1 -ETO et leucemogénèse : nécessaire et/ou suffisant ? (2) AML 1 -ETO Knock/In absence d’hématopoièse fœtale hépatique mort des souris (Downing, Zhang, August, 2001, vol 98, n° 18) Souris transgèniques AML 1 -ETO avec promoteur myeloide-spécifique Expression dans le compartiment myéloide hématopoièse normale AML 1 -ETO seul ne suffit pas Si traitement ENU (mutation dans l ’ADN) LA

Class I Mutations Class II Mutations BCR/ABL, FLT 3 -ITD AML 1/ETO, PML/RARa, C/EBPa lossof function Therapy : eg, imatinib mesylate, FTL 3 inhibitors Therapy : eg, ATRA AML

Blocage de differenciation + prolifération ØFLT 3 ØC-Kit ØRAS

835/836

FLT 3 review (Kottaridis et al, BJH 2003)(3) Thiede et al n % 979 20. 4 - hyperleucocytose - M 3 V Schnittger et al 1003 23. 5 - M 5 - M 2 Kattaridis et al 854 27 - caryotype normal -11 q 23 <0. 5% - t(6, 9) - Rare CBF Pas d’influence sur la RC, des rechutes

RAS • 3 gènes : N, K, H RAS • Mutations codons 12, 13, 61, autres • LAM : N>K>H RAS • 10 à 15% de mutations (25% dans les CBF) Valeur pronostique contreversée

Bilan : selon le caryotype

Groupes pronostiques (1) Selon le caryotype (MRC) OS favorable intermédiaire défavorable P=0. 30 (NS)

Groupes pronostiques (3) Conclusion : Nouvelle classification proposée : OS Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 groupe 1 : MRC 1, CEBP+, FLT 3 groupe 2 : MRC 2, RAS- et gpe 1 FLT 3+, groupe 3 : MRC 3, RAS+ P=0. 006

C-Kit • Récepteur Stem Cell Factor • Mutation ponctuelle dans mastocystose (codon 816) • LAM : 1, 5% mutation mais inv(16) : 10 -25% délétion exon 8 ; 5% D 816 t(8; 21) : 5% délétion exon 8 ; 5% D 816 Associé à un risque de rechute augmenté

Survie et rechute des LAM avec mutation de c-Kit exon 8 D’après Care et al. , Br J Haematol, juin 2003

All N=81 Age (y) 33 [. 8 -60] Sex Ratio (M/F) 44/37 WBC (G/L) 21 [1. 7 -257] t(8; 21) N=58 inv(16) N=33 30. 5 [4 -58] 29/19 13. 4 [1. 7 -155] 34 [. 8 -60] 5/18 58. 6 [4 -257] NS NS p=. 0001 11% (5/42) 7% (3/42) 4% (2/49) 4% (2/48) 11% (4/38) 8% (3/40) 3% (1/38) 19% (6/32) 16% (5/32) 3% (1/32) 9% (3/33) 33% (11/33) 27% (9/33) 9% (3/33) NS NS p=. 02 p=. 03 NS Mutations KIT 15% (11/74) Ex 8 11% (8/74) D 816 4% (3/74) FLT 3 -D 835 6% (5/81) RAS 21% (15/71) N-RAS 16% (12/73) K-RAS 6% (4/71)

1 1 , 8 RTK- , 6 EFS OS CBF RTK- , 6 , 4 RTK+ , 2 P=. 0007 2 P=. 004 0 0 0 RTK+ , 2 4 6 Years 8 10 0 2 4 6 Years 8 10

t(8; 21) inv(16) 1 1 , 8 RTKOS OS , 6 , 4 , 6 RTK+ , 4 RTK+ , 2 0 RTK- , 2 P=. 0007 0 2 0 4 6 Years 8 10 P=. 06 0 2 4 Years 6 8 10

Multivariate analysis (OS) RTK Mutation CBF (t(8; 21) vs inv 16) Age* WBC* *continuous variables RR 3. 50[1. 56 -6. 85] 3. 03[1. 01 -8. 39] 1. 005[. 998 -1. 012] 1. 005[. 982 -1. 030] P value. 002. 04 NS NS

BAALC (Brain And Acute leukemia cytoplasmic) - Localisé en 8 q 22. 3 - Corrélation entre +8 et hyperexpression de BAALC - Baldus et al, Blood 2003 80 caryotypes normaux < 60 ans CAL GB 9621 - Résultats • pas de différence age, sexe, flt 3, NP, Hb mais BAALC faible : leuco et M 5 • pas influence sur RC • BAALC survie : 1. 7 VS 5. 8 years EFS : 0. 8 VS 4. 9 years DFS 1. 4 VS 7. 3 years

- Facteur pronostic indépendant D’après Baldus et al, Blood 2003

EVI 1 - Localisé en 3 q 26 - Anomalies rares mais de mauvais pronostic - t(3; 3) ou inv(3) hyperexpression EVI 1 et/ou EVI 1 -MDS 1 - Groupe Hollandais, Blood 2003 • 319 patients • RQ-PCR : EVI 1 + MDS 1 - 6 patients Groupe I EVI 1 + MDS 1 + 26 patients Groupe II EVI 1 - MDS 1 + 12 patients Groupe III EVI 1 - MDS 1 - 275 patients Groupe IV - EVI 1 : lié à caryotype défavorable - lien avec 11 q 23 - groupe I et II : pronostic très défavorable

Ÿ Courbes de survie

p = 0, 01 p = 0, 008

ETUDE DU PHENOTYPE MDR P. Lepelley - Laboratoire d ’Hématologie - CHU de LILLE 22 oct

PHENOTYPE MDR • Expression cellulaire de protéines de transport • Efflux et/ou redistribution intracellulaire • Résistance croisée • - Glycoprotéine-P (MDR 1) - MRP (multidrug resistance associated protein) • - LRP (lung resistance protein) - BCRP (breast cancer resistance protein)

Expression de Pg. P, MRP, LRP, BCRP Intérêt pronostic de la Pg. P Etudes discordantes : problèmes méthodologiques

TEST FONCTIONNEL D ’EFFLUX DE LA RHODAMINE 123 Rh 123 (200 ng/m l) 45 mn 20°C • Marqueur mitochondrial (523 nm) • 2 temps: Accumulation (A) Efflux (E) +/- Vérapamil(V) Spécifique de la Pgp MRP: efflux+/- > 4 h non inhibé par Vp Efflux 2 H 37°C + Vérapamil (10 g/ml)

Phénotype MDR / Pg. P dans les LAM et SMD (247 pts) Age moyen: 56 ans, 96 pts<55 ans - 151 pts >55 ans 20 cas (9 neg) étudiés au diag et en rechute/acutisation pas de conversion Corrélation avec l ’age (p<0. 001) et avec CD 34 (p < 0. 001)

FACTEURS PRONOSTIQUES DES LA LAM préthérapeutique • Age • Leucocytose • Cytogénétique • “FAB” + DMP • Phénotype • 2ème VS de novo + mutations : FLT 3 RAS CEBPA P 53 c. Kit Autres LAL chimiosensibilité • Délai de RC • Maladie résiduelle • Chimio sensibilité • Maladie résiduelle

LA MALADIE RESIDUELLE Nombre de blastes 1012 1011 1010 Clinique Cytologie 10 -2 PCR 10 -5 Temps Chimiothérapie Rémission complète

INTERETS DU SUIVI DE LA MALADIE RESIDUELLE PAR RQ-PCR DANS LES LEUCEMIES AIGUES MYELOIDES PRESENTANT UNE TRANSLOCATION t(8; 21)

MATERIEL ET METHODES I. PATIENTS 21 patients homogènes 2 allogreffes 2 interruptions thérapeutiques précoces Age médian : 46 ans 235 prélèvements sanguins et médullaires 29 patients suivis au CHRU de Lille (1994 - 2003) 27 échantillons concomitants de moelle et de sang 5 LAM 1 20 LAM 2 1 LAM 4 3 inconnus

RESULTATS I. ANALYSE GLOBALE Ø Patients 100% de rémission complète en post-induction 10 patients rechutent (10 à 37 mois après le diagnostic) Survie globale moyenne : 101 mois Survie moyenne sans rechute : 70 mois Ø Résultats de RQ-PCR 8 échantillons exploitables par patients. 28, 5 mois de médiane de suivi Valeur médiane du taux de transcrit au diagnostic : 9. 10 -1 (0, 23 à 31, 3) Valeur médiane du taux de transcrit à la rechute : 4, 86. 10 -1 (2, 3. 10 -3 à 24, 6)

RESULTATS III. COURBES DE MR DES 21 PATIENTS HOMOGENES Ø Catégorisation des patients 3 groupes identifiés en fonction de l’évolution des courbes de suivi : P Groupe A : 8 patients ÊMR < 10 -5 en post-induction c Groupe A : 1 seule rechute

RESULTATS P Groupe B : 7 patients ÊMR < 10 -5 dans les 6 premiers mois c Groupe B : 0 rechute

RESULTATS P Groupe C : 6 patients ÊPas de MR < 10 -5 dans les 6 premiers mois c Groupe C : 5 rechutes

RESULTATS Ø Facteurs pronostiques identifiés P Catégories établies en fonction de la MR à 6 mois Temps avant rechute / Catégories 1 / 15 * : patients du groupe A + B - - - : patients du groupe C 5/6* * : nbre de rechute p = 0, 00001 c différence très significative c absence de passage de MR sous 10 -5 dans les 6 mois = facteur de mauvais pronostic

RESULTATS P Catégories établies en fonction de la MR post-induction PFS / valeur MR post-induction (seuil = 10 -3) PFS / perte 3 log de MR après l’induction 1 / 10 * 2 / 12 * 5/8* * : nbre de rechute 4/6* p = 0, 006 * : nbre de rechute p = 0, 01 : patients dont la MR post-induction est < 10 -3 : patients perdant + de 3 log de MR après l’induction ---- : patients dont la MR post-induction est > 10 -3 ---- : patients perdant - de 3 log de MR après l’induction - MR > 10 -3 en post-induction - Chute < 3 log en post-induction c différence très significative = facteur de mauvais pronostic

RESULTATS V. COMPARAISON MR MOELLE ET SANG 27 prélèvements concomitants de moelle et de sang P Différence MRmoelle - MRsang : entre -1, 27 et +1, 37 ; moyenne à -0, 13 1, E+02 1, E+01 1, E+00 1, 0539 y = 2, 0894 x 2 R = 0, 9526 MR Sang 1, E-01 1, E-02 1, E-03 1, E-04 1, E-05 1, E-06 1, E-07 1, E-06 1, E-05 1, E-04 1, E-03 1, E-02 1, E-01 1, E+00 1, E+011, E+02 MR Moelle c Coefficient de détermination à 95% = MRmoelle et MRsang comparables

Scnittger et al, BLOOD, 2003

Krauter et al , JCO 2004

Others transcripts • Very few data • * MLL AF 9 * multiple splice site : difficult * scholl et al : GCC, November 2003 • 8 patients + 2 cell lines • Feasibility of RQ PCR : OK • But sensitivity : LOW * less than 20 samples analyzed No clinical relevance demonstrated

WT 1 • Tumor suppressor gene located on chromosome 11 p 13 • Involved in pathogenesis of wilms tumor • High expression in ovary, testis, spleen • Expression observed in more than 80% of AML • Expression low in PB but variable in BM • Qualitative RT PCR : few interest for MRD • RQ PCR : more interesting in PB than in BM

Cillioni et al, Leukemia, 2002

835/836

Kottaridis

Maladie résiduelle dans leucémies aiguës myéloïdes: approche cytométrique L. Campos P. Flandrin Laboratoire d ’Hématologie Hôpital Nord - CHU de St. Etienne

Phénotypes associés à la leucémie • Expression croisée d’antigènes: marqueurs lymphoïdes sur cellules myéloïdes (ou inverse). • Expression asynchrone d’antigènes: coexpression d’antigènes de maturité et d ’immaturité d’une même lignée. • Surexpression antigénique: augmentation d ’expression d ’un antigène sur une cellule. • Cellules exprimant des propriétés aberrantes en taille et structure.

Orfao et San Miguel (Blood 2001): 126 LAM en rémission complète, après la chimiothérapie d ’induction, >10 -2 : élevé 10 -3 -10 -2 : intermédiaire 10 -3 -10 -4 : faible < 10 -4 : très faible

Survie sans rechute à 3 ans:

Venditti ( 2002): 56 patients, après chimiothérapie d ’induction et de consolidation, résultats: après induction: taux cellules avec phénotype aberrant = 4. 5 x 10 -4. (seuil) > 4. 5 x 10 -4 : 53 % de rechute < 4. 5 x 10 -4 : 40 % de rechute.

après consolidation: taux = 3. 5 x 10 -4. > 3. 5 x 10 -4 : 77 % de rechute. < 3. 5 x 10 -4 : 17 % de rechute. L ’étude de la maladie résiduelle après consolidation semble + prédictive du risque de rechute.

Probabilité de survie en fonction de MDR après consolidation (Venditti, 2000)

Laboratoire d’Hématologie A Calmette U 524 Inserm A. Cosson Laboratoire de Génétique N. Grardel Médicale CHRU Lille J. P. Kerckaert P. Lepelley J. Andrieux H. Leroy J. L. Laï C. Roche C. Roumier V. Soenen Membres du Groupe ALFA Techniciens Membres du GBMHM « Intergroupe LAM » Cliniciens MDS CHRU Lille F. Bauters S. De Botton B. Quesnel « P. Fenaux »