BIOLOGIA MOLECULAR Tecnologia do DNA recombinante FABIANA SEIXAS

BIOLOGIA MOLECULAR Tecnologia do DNA recombinante FABIANA SEIXAS email: fabianak@ufpel. edu. br

ABORDAGENS. . . 1. DNA recombinante 2. Enzimas de restrição 3. Vetores de Clonagem - Plasmídios - Bacteriófagos - Cosmídeos 4. Etapas de Clonagem Molecular 5. Aplicações

O que é um DNA recombinante? - É uma molécula de DNA formada pela ligação de duas moléculas de origens diferentes (Ex. DNA de planta ligado a um plasmídio)

DNA RECOMBINANTE

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Descritas em 1970, W. Alber H. Smith D. Nathans • Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva uma fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO A enzima Bam. HI reconhece a seqüência dupla fita: Bam. HI - reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA palíndromos, atuando como verdadeiras tesouras moleculares

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Nomenclatura • Bam. HI - Bacillus amyloliquefaciens H 5’ G/GATCC 3’ • Eco. RI - Escherichia coli R 5’ G/AATTC 3’ • Hae. III - Haemophilus aegyptius 5’ GG/CC 3’ • Pst. I - Providencia stuartii 5’ CTGCA/G 3’

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 370 C, 1 hora, com tampão adequado

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Tipos de cortes: - Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) - Produção de terminais abruptos (ou cegos)

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 181 Nar. I ~~~~~~ ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG 241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA 301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA 361 421 Hind. III Pst. I ~~~~~~~ TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC Xba. I Bam. HI Kpn. I Eco. RI ~~~~~~~ ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA

TIPOS DE VETORES

TIPOS DE VETORES Vetores Plasmídeos Cosmídeos Bacteriófagos Hospedeiros Bactérias / leveduras Utilização clonagem

VETORES PLASMIDIAIS • Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossômico, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras – p. UC 18 – p. BR 322 – p. UP 310 Ob. : Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb

VETORES PLASMIDIAIS Vetor de Expressão em Procarioto

VETORES PLASMIDIAIS Vetor de Expressão em Eucariotos

Vacina Vetorizada (r. BCG)

VETORES PLASMIDIAIS Vetor de Expressão em Eucariotos

BACTERIÓFAGO - Vírus que infectam bactérias; - DNA ou RNA; - Capsídeo - Biologia do fago - Utilizados para clonar fragmentos de 9 kb a 25 kb

BACTERIÓFAGO Ciclo Lítico Ciclo Lisogênico

COSMÍDEOS -São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;

VETORES DE CLONAGEM • Replicação autônoma • Marcador de seleção (antibiótico) • Sítio único de clonagem

VETORES DE EXPRESSÃO • Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG • Promotores induzíveis • Sinais de secreção • Fusão com proteínas carreadoras

CLONAGEM MOLECULAR

CLONAGEM MOLECULAR • É o isolamento e a propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA

CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparação do vetor 3. Ligação do vetor com o “inserto” 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

1. Obtenção do DNA a ser clonado - Extração de DNA; PCR Digestão Purificação

1. Obtenção do DNA a ser clonado PCR 94 0 C por 5 min 94 0 C por 1 min 55 0 C por 1 min 72 0 C por 5 min 4 0 C 35 ciclos

Eletroforese em gel de agarose

Visualização do DNA em luz ultravioleta

3. Preparação do vetor • Digestão • Purificação Plasmídeo Circular Plasmídeo linear Digestão com Enzimas de restrição

4. Ligação Extremidades coesivas Fragmento de DNA inserto LIGASE DNA plasmidial vetor

CHOQUE TÉRMICO 5. Transformação da bactéria

ELETROPORAÇÃO 5. Transformação da bactéria

ELETROPORAÇÃO 5. Transformação da bactéria

6. Seleção dos clones recombinantes

Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo circular Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

Extração de DNA de L. interrogans Leptospira interrogans PCR 94ºC – 5 min 94ºC – 1 min 50ºC – 1 min 72ºC – 7 min 30 ciclos meio EMJH Extração de DNA

Construção dos Vetores PCR Clonagem em Vetores de expressão Transformação E. coli Seleção dos Clones recombinantes lip. L 32 768 pb Triagem Digestão Extração 768 pb

Expressão de Proteínas Recombinantes Transformação da E. coli Cultura de Células Purificação da Proteína

Purificação de proteínas recombinantes Ligação Transformação por Eletroporação Extração de DNA plasmidial E. Coli DH 5 p. Lys. S Transformação por Choque Térmico E. coli (BL 21) codon pluss SI DE 3 Cepas de E. coli para expressão de proteínas

SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas) SDS-PAGE

Expressão de Proteínas Recombinantes Expressão em diferentes cepas de E. coli

Purificação de Proteínas Recombinantes Akta Prime Gel de poliacrilamida 15%. 1 2 3 4 30 k. Da 1. BENCHMARKTM Protein Ladder em k. Da 2, 3 e 4. Lip. L 32 purificada (eluições).

APLICAÇÕES

VACINAS RECOMBINANTES 1. PCR L. interrogans lip. L 32 2. Clonagens p. AE 3. Multiplicação p. TARGET E. coli (BL 21) Vetor Plasmidial Vetor Plasmidia l p. US 973 p. US 974 p. US 977 Vetor Plasmidia l E. coli TOP 10 Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidia l 4. Vacinação Vetor Plasmidi al Proteína Recombinante Vacina de DNA Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al BCGr Vetor Plasmidia l Vetor Plasmidial

ANIMAIS TRANSGÊNICOS

PLANTAS TRANSGÊNICAS