Biologia komrki 1 wiczenie Regulacja cyklu komrkowego 1

Biologia komórki 1

Ćwiczenie Regulacja cyklu komórkowego 1. Molekularne mechanizmy regulacji cyklu komórkowego. Rola cyklin i kinaz CDK. 2. Unieśmiertelnione hodowle komórkowe. Linia K 562. 3. Metody badania cyklu komórkowego. Cytometria przepływowa. 4. Interfaza. Chromatyna płciowa (ciałko Barra, pałeczka dobosza)

Ćwiczenia • Ćw 1. Barwienie DNA komórek K 562 za pomocą DAPI. • Ćw 2. Barwienie DNA komórek K 562 jodkiem propidyny (PI) • Ćw 3. Obserwacja chromatyny płciowej w rozmazach jamy ustnej człowieka

Rycina 1. Schemat cyklu komórkowego z zaznaczonymi punktami kontrolnymi. Punkt kontrolny G 1 jest blisko końca fazy G 1 (blisko przejścia między fazami G 1 i S). Punkt kontrolny G 2 jest blisko końca fazy G 2 (blisko przejścia między fazami G 2 a M). Punkt kontrolny wrzeciona podziałowego jest w środku fazy M, a dokładniej w przejściu między metafazą i anafazą.

Rycina 2. Ekspresja cyklin w cyklu komórkowym. Rysunek pokazuje jak zmienia się stężenie poszczególnych cyklin w komórce w trakcie trwania cyklu komórkowego.

Materiał badawczy linia komórkowa K 562 • Linia komórkowa wyprowadzona została z komórek 53 -letniej kobiety cierpiącej na przewlekłą białaczkę szpikową • Komórki K 562 były pierwszą ludzką unieśmiertelnioną linią komórkową białaczki szpikowej • Komórki K 562 są typu erytroleukemicznego • Komórki nie są adherentne tzn. aby się namnażać nie wymagają związania się z podłożem. Brak kontaktu z podłożem powoduje, że komórki przybierają zaokrąglone kształty, • Wykazują pewne podobieństwo proteomiczne zarówno do niezróżnicowanych granulocytów, jak i erytrocytów.

Materiał badawczy Komórki nabłonka jamy ustnej Jamę ustną człowieka pokrywa nabłonek wielowarstwowy płaski, który zbudowany jest z komórek określanych jako keratynocyty.

Cytometria przepływowa

Początki cytometrii przepływowej • 1934 r. – A. Maldaven wykorzystał detektor fotoelektryczny przyłączony do okularu mikroskopu oraz kapilarę przez którą przepływały komórki. Kapilara często ulegała zatkaniu • 1953 r. – P. J. Crosland-Taylor opracował metodę ogniskowania hydrodynamicznego

Cytometria vs. Cytomeria przepływowa Cytometria / mikroskopia • Umożliwia lokalizację antygenu • Słaba identyfikacja podtypów komórek • Ograniczenie liczby jednoczesnych pomiarów Cytometria przepływowa • Brak możliwości określenia lokalizacji • potrafi analizować wiele komórek w krótkim czasie (30000/s) • Możliwość analizy wiele parametrów naraz (> 20)

CYTOMETRIA PPZEPŁYWOWA • Cytometria przepływowa to metoda pomiaru pojedynczych komórek lub cząsteczek przepływających przez aparat w strumieniu cieczy. • FACS (Fluorescence Activating Cell Sorting) rozszerzona metoda cytometrii przepływowej, w której oprócz pomiarów komórek są stosowane również urządzenia sortujące.

MIERZONE SYGNAŁY • rozproszenie światła przez badaną próbkę, • intensywność fluorescencji składników komórki, lub zastosowanych barwników, • absorbcja światła przez próbkę, • pomiary w czasie (użyteczne dla badania kinetyki, dynamicznych zachowań populacji komórek)

ELEMENTY BUDOWY CYTOMETRU

Podsystemy cytometru przepływowego • 1) system hydrodynamiczny • 2) optyka • 3) elektronika

TUBA Z LAMINARNYM PRZEPŁYWEM PRÓBKI • pojedyncze komórki (zawiesiny) • przepływ w cienkim strumieniu cieczy przez oświetlaną objętość umożliwia pomiar pojedynczych komórek.

Przepływ komórek tu nakładamy próbkę promień lasera ciecz osłaniająca

System hydrodynamiczny Sample in Sheath Piezoelectric crystal oscillator Sheath in Fluorescence Sensors Signal direction Laser beam Scatter Sensor Sheath Core Flow Chamber

Optyka • Żródło światła: laser, lampa rtęciowa, dioda • Detektory: fotopowielacze (photomultiplier PM) • Filtry optyczne, lustra

System optyczny PMT 5 próbka PMT 4 lustro dichroiczne PMT 3 przepływ komórek detektor światła rozproszonego PMT 2 PMT 1 filtr zaporowy laser

Światło rozproszone

PRZEDNI DETEKTOR ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO (Forward Scatter - FS) • Ilość światła rozproszonego wzdłuż osi przebiegu światła wzbudzającego jest zbierana przez przedni detektor światła rozproszonego (forward scatter channel). Intensywność tego światła jest proporcjonalna do wielkości komórek.

PRZEDNI DETEKTOR ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO (Forward Scatter - FS) Laser Beam. 50 -80 FS Detector

Rozróżnianie rozmiarów komórek 700 200 Number of events 90 20 0. 9 small 0. 1 large 1 10 100 Particle or cell size (log scale) 1000 Podczas rozpraszania światła w przód (FS) nie zawsze jest związane z rozmiarem komórki. W większości przypadków między 1 -20 mikrometrów jest to wiarygodne oszacowanie

BOCZNY DETEKTOR ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO (Side Scatter - SS) • Ilość światła rozproszonego prostopadle do osi przebiegu światła wzbudzającego jest zbierana przez boczny detektor światła rozproszonego ustawiony pod kątem 90 stopni (side scatter channel). Sygnał z tego detektora uznawany jest za informujący o strukturze (ziarnistości, kształcie) jądra.

BOCZNY DETEKTOR ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO (Side Scatter - SS) laser SS detektor

Fluorescencja Wzbudzenie i emisja Definicja • Fluorescencja – jeden z rodzajów luminescencji – zjawisko emitowania światła przez wzbudzony atom lub cząsteczkę. Zjawisko uznaje się za fluorescencję, gdy po zaniku czynnika pobudzającego następuje szybki zanik emisji w czasie około 10− 8 s.

Wzbudzenie fluorescencji

Colors • • 488 nm długość fali świetlnej lasera najczęściej wykorzystywana w cytometrii przepływowej Wiele urządzeń wyposażonych jest kilka dodatkowych laserowych zrodeł światła – – 355 nm UV 405 nm Fioletowy 640 nm Czerwony 561 nm Żółto -Zielony

Detektory fluorescencji • Fotopowielacze (ilość od 2 do 4) • Można używać kilku barwników fluorescencyjnych lub wyznakowanych przeciwciał. • Selektywność sygnału zapewniają odpowiednio dobrane filtry optyczne i lustra.

Detektory fluorescencji detektor przedni laser Fluorescence detektory fluorescencji (PMT 3, PMT 4 etc. )

Eletronika • Urządzenia do przetwarzania sygnału na obraz (wartości) cyfrowe, • System komputerowy do przechowywania i obróbki danych

PARAMETRY MIERZALNE ZA POMOCA CYTOMETRU STRUKTURALNE rozmiar, kształt, cytoplazmatyczna ziarnistość, zawartość barwnika np. : hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne, porfiryny, • aminokwasy fluoryzujące w białkach np. : tryptofan, tyrozyna, • zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów powierzchniowych, antygenów, • • •

PARAMETRY MIERZALNE ZA POMOCA CYTOMETRU • • FUNKCJONALNE ładunek powierzchniowy, ekspresja receptorów powierzchniowych, integralność błony (żywotność), aktywność endocytarna, organizacja cytoszkieletu, aktywność enzymów,

WIELOPARAMETROWA ANALIZA • Do analizy i obrazowania danych stosuje się kilka typów wykresów: – jednowymiarowe (histogramy), – dwuwymiarowe (kropkowe, gęstości, – konturowe), – wykresy trójwymiarowe (perspektywiczne).

Histogram – podstawowa reprezentacja wyników w cytometrii przepływowej liczba zliczeń histogram Wartość parametru (np. fluorescencji)

Liczba zdarzeń Histogram Zmierzona wartość

Histogram – podstawowa reprezentacja wyników w cytometrii przepływowej Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej • pik G 0 -G 1 odpowiada ilości DNA = 2 n w fazie G 0 i G 1 • obszar S to rozkład zawartości DNA w fazie S cyklu komórkowego • pik G 2 -M odpowiada ilości DNA = 4 n w fazie G 2 i M Cell Count 300 G 0 - G 1 G 0 G 2 225 G 1 s 150 75 0 G 0 M s 0 200 G 2 M 400 600 2 N DNA Content 4 N 800 1000

liczba zliczonych komórek Typowy histogram DNA 2 n 4 n G 0 -G 1 G 2 -M S Intensywność fluorescencji

Histogram zawartości DNA w komórkach K 562 (cykl komórkowy)

Cytometria przepływowa komórek apoptotycznych Komórki apoptotyczne zliczenia Normalne G 0/G 1 komóki PI - Fluorescencja

WYKRES DWUWYMIAROWY (KROPKOWY)

Light Scatter Gating Side Scatter Projection Forward Scatter Neutrophils Forward Scatter Projection Monocytes Lymphocytes 0 200 400 600 800 90 Degree Scatter Human white blood cells 1000

WYKRES DWUWYMIAROWY (KROPKOWY) PI FL 2 -H • PI – jodek propidyny barwi DNA martwych komórek • Aneksyna- FITC (fluoresceina) –łączy się z fosfatydyloserną obecną w na zewnątrz błony komórek apoptotycznych komórki martwe aneksyna V-FITC FL 1 -H komórki żywe komórki apoptotyczne

PODSUMOWANIE: zalety cytometru przepływowego • W zależności od jakości cytometru można badać koekspresję nawet czterech antygenów, co nie jest możliwe w żadnej innej metodzie • Analizowanie bardzo licznych populacji obiektów w krótkim czasie, pozwala osiągnąć wysoką dokładność i zminimalizować rozrzut wyników. • W ciągu kilku sekund można z niezwykłą dokładnością i powtarzalnością wykryć subpopulacje rzadko występujące i nietypowe • Ogólnie, cytometria przepływowa jest wspaniałym nieinwazyjnym (tzn. nie naruszającym integralności komórkowej) narzędziem badawczym w wieloparametrowej ocenie struktury i funkcji komórek. • Umożliwia oznaczenia ploidii w komórkach o określonym fenotypie

Chromatyna płciowa Ciałko Barra i pałeczka dobosza

Ciałko Barra • To strukturalne znaczniki chromatyny płciowej • Ciałko Barra inaczej chromatyna płciowa to chromosom X inaktywowany w komórkach żeńskich somatycznych

ciałko Barra (duże skupisko heterochromatyny pod powierzchnią otoczki jądrowej) kobieta brak ciałek Barra mężczyzna

U mężczyzn chromosom X i Y ulegają koniugacji podczas mejozy Chromosomy X i Y posiadają wspólny region, zwany regionem pseudoautosomalnym. Region ten jest niezbędny do prawidłowej koniugacji i segregacji tych chromosomów. Większość chromosomu Y nie rekombinuje z chromosomem X - w tych rejonach zlokalizowane są geny odpowiedzialne za płodność mężczyzn. Chromosomy heterosomalne: chromosomy płciowe X i Y Komórki ludzkie mają 22 pary chromosomów autosomalnych

Chromosomy X i Y nie są homologiczne

Geny zlokalizowane na chromosomie Y • Chromosom Y zaobserwowano po raz pierwszy w 1923 r. • Końce ramion chromosom Y to rejony pseudoautosomalne (PAR 1 i PAR 2) • Stanowią one ok. 5% chromosomu • Chromosom Y zawiera 63 pseudoautosomalne geny które uczesniczą w procesie crossing over z chromosomem X

Geny zlokalizowane na chromosomie Y • Chromosom Y ma 2 pseudoautosomalne rejony w których zlokalizowane są geny, które mają swoje odpowiedniki na chromosomie X. • Duża centralna część chromosomu Y nie rekombinuje z chromosomem X. • Ten niepodlegający rekombinacji obszar zajmuje około 95% chromsomu Y.

Kompensacja dawki genów • Sex Chromosomes: kobieta XX, mężczyzna XY • Kobieta ma dwie kopie genów związanych po jednym na każdym chromosomie X; mężczyzna ma tylko jedną kopię (allel) genu. • W jaki sposób kompensuje się tę różnicę w dawce genów? • Jak stworzyć równą ilość produktów genu chromosomu X u mężczyzn i kobiet?

• Inaktywacja chromosomu X (wyciszenie transkrypcyjne) ma na celu wyrównanie dawki większości genów sprzężonych z chromosomem X między organizmami żeńskimi (46, XX) i męskimi (46, XY)

Proces lionizacji • Podczas wczesnych mitotycznych podziałów zygoty w żeńskich komórkach somatycznych człowieka obydwa chromosomy X są aktywne; w 16 dniu życia zachodzi lionizacja, czyli trwała losowa inaktywacja jednego z dwóch chromosomów X, pochodzenia matczynego lub ojcowskiego (mozaicyzm w komórkach żeńskich somatycznych)

Proces lionizacji

Ciałka Barra Normalny mężczyzna, Zespół Turnera Normalna kobieta, Zespół Klinefeltera 0 1 2 3

UWAGA! • Proces inaktywacji rozpoczyna się w obrębie centrum inaktywacji w chromosomie X; następnymi etapami są rozprzestrzenianie się i utrwalanie inaktywacji. • W komórkach rozrodczych człowieka proces inaktywacji chromosomu X podczas oogenezy orza spermatogenezy przebiega inaczej niż w komórkach somatycznych • Zinaktywowany chromosom X nabywa cech, które odróżniają go od aktywnego chromosomu X i chromosomów autosomowych (stopień metylacji, acetylacji i kondensacji ora poziomu ekspresji genów) • Inaktywacja chromosomu X jest wynikiem zahamowania acetylacji histonu H 4 jednego z chromosomów X • Uwaga. Procesowi inaktywacji nie ulega cały materiał genetyczny chromosomu X. Część genów zachowuje aktywność transkrypcyjną (np. gen determinujący grupę krwi, antygen CD 99, translokazę ADP/ATP)

-W 1968 r. Międzynarodowy Komitet Olimpijski wprowadził badanie obecności ciałek Barra w rozmazach z jamy ustnej jako metodę ustalania płci zawodników. - W 1992 r. na Olimpiadzie w Barcelonie testy z wykorzystaniem ciałka Barra zastąpiły techniki PCR.

Pałeczka dobosza

Student Hasło: ZBK 2. 99 Login: