BIOFILM Lkask mikrobiologie cvien jarn semestr 2016 Mikrobiologick
BIOFILM Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU www. p 2 probioticpower. com
Osnova �Co je biofilm? �Vznik biofilmu �Druhové zastoupení biofilmu �Diagnostické metody pro detekci biofilmu
Co je biofilm? �Biofilm je organizované společenství mikroorganismů tvořící se na rozhraní fází (nejběžněji na rozhraní pevné / kapalné prostředí). �Jeden z klíčových virulenčních faktorů. �Organismy žijící ve formě biofilmu vykazují odlišné vlastnosti od planktonně žijících organismů (odlišná rychlost růstu, transkripce odlišných genů, . . . ). �Výskyt: medicína, vodárenský průmysl, potravinářství, příroda, . . .
Proč žít ve formě biofilmu? �Z takto vzniklého společenství plynou mikroorganismům mnohé výhody: q Ochrana před chemickými látkami q Mechanická ochrana q Vliv na účinek ATB q Výměna genetické informace (rezistence) q Kooperace mezi jednotlivými druhy q Vytvoření „biofilmové homeostázy“ q Ochrana před účinkem imunitního systému
Biofilm v průmyslu www. earlywarninginc. com
Biofilm v medicíně www. podiatrytoday. com, www. iab. kit. edu
Vznik biofilmu (1) �Adheze na povrch: q adsorpce organických molekul na povrch nosiče q adsorpce mikrobů na povrch – reverzibilní ireverzibilní. Tohoto procesu se účastní fyzikální van der Waalovy síly, hydrofobní a elektrostatické interakce, dále nespecifické chemické vazby (vodíkové můstky, polární a kovalentní vazby) a specifické interakce (účast adhezinů, fimbrie, pili, bičíky). Primární kolonizátor se množí na povrchu vznik mikrokolonií. o o Primární kolonizátor se množí na povrchu vznik mikrokolonií. Nasedání dalších buněk stejného i odlišného druhu – fáze akumulace a agregace biofilmu. Opět princip adheze.
Vznik biofilmu (2) �Tvorba exopolysacharidů a dozrávání biofilmu q Exopolysacharidy vyplňují prostor mezi jednotlivýmu buňkami biofilmu – závisí na okolních fyzikálních i chemických podmínkách �Uvolnění buněk zralého biofilmu, šíření dále do těla – možno jak chemicky, fyzikálně, tak enzymaticky (quorum sensing)
Vznik biofilmu (3) 1) reverzibilní adheze � 2) ireverzibilní adheze � 3) tvorba mikrokolonií, koadheze � 4) zrání biofilmu � 5) disperze, šíření biofilmu �
Vznik biofilmu (4) �Doba trvání jednotlivých fází
Složení biofilmu �Biofilm může být jednodruhový či vícedruhový. �Obsahuje buňky jednotlivých zástupců biofilmu a extracelulární matrix vyplňující prostor mezi buňkami. �Extracelulární matrix obsahuje: � Voda (až 97 %) � (Mikrobiální buňky (2 -5 %) ) � Polysacharidy (1 -2 %) � Proteiny (< 1 -2%) – výsledek lyze, enzymy � DNA a RNA (< 1 -2%) – z lyzovaných buněk � Ionty – vázané i volné
Regulace biofilmu – Quorum sensing �Detekce okolních buněk, jejich polohy a množství pomocí systému „quorum sensing“ pomocí chemických signálů (nejčastěji laktony, oligopeptidy, . . . ). �Účelové chování buňky – produkce signálních molekul a jejich kumulace při překročení prahové koncentrace dojde ke změně exprese geů (signální molekula se naváže na membránový receptor na povrchu buňky). �Buňky takto mohou reagovat na stres, hustotu populace, p. H, množství živin v okolí, . . .
Biofilm jako faktor virulence �Velice významný faktor – ochrana mechanická, chemická, před imunitním systémem, vliv na účinek ATB, výměna genetické informace mezi členy společenstva. �Biofilm má podíl především na chronických infekcích (do souvislosti s přítomností biofilmu se dává až 80 % všech infekcí!). �Častý výskyt u pacientů s plicními infekcemi (cystická fibróza, intubovaní pacienti), s močovými infekcemi (katetrizovaní pacienti).
Antimikrobiální rezistence biofilmu (1) �Mikroorganismy ve formě biofilmu tolerují až 100 – 1000 x větší dávky antimikrobiálních látek než planktonně žijící. �Proč? q Extracelulární matrix snižuje difúzi léčiva – mechanická bariéra q Povrchový náboj – náboj matrix ztěžuje vstup polárních a nabitých ATB + vychytávání ATB) q Gradienty v biofilmu – různé vrstvy biofilmu mají různé prostředí (např. některá ATB nepůsobí v anaerobním prostředí, ale pouze na okraji biofilmu)
Antimikrobiální rezistence biofilmu (2) �Mikroorganismy ve formě biofilmu tolerují až 100 – 1000 x větší dávky antimikrobiálních látek než planktonně žijící. �Proč? q Většina ATB lépe působí na rostoucí buňky pomale rostoucí spodní vrstvy tak rychleji začnou ATB tolerovat q Výměna genetické informace mezi jednotlivými zástupci (možný vznik rezistentních mutant) q Horizontální přenos genů q Perzistující varianty mikroorganismů – zodpovědné za relapsy onemocnění
Eradikace biofilmu �Velice obtížná. �Antimikrobiální léčba většinou potlačí pouze symptomy, tedy infekce způsobené planktonními buňkami uvolněnými z matrix biofilmu buňky ve formě biofilmu většinou nejsou zasaženy. �Je nutno použít velmi vysokých koncentrací antimikrobiální látky, ideálně v kombinaci. �Pokud léčba stále selhává (což se většinou bohužel děje) vyjmout ložisko biofilmu (implantát, katétr, . . . ). �Nové možnosti – např. enzymoterapie.
Prevence vzniku biofilmu �Vhodná volba impantátu a materiálu, z nějž je implantát vytvořen (nová generace plastů, impregnace koloidním stříbrem, antimikrobiálními látkami). �Proškolený personál dodržující pravidla asepse a dekontaminace. �Preventivní podání ATB u ohrožených pacientů.
Diagnostika biofilmu (1) �Průkaz biofilmu: q Fenotypové metody (Christensenova metoda, kultivace na agaru s kongo červení) q Kvantifikace vrstvy biofilmu (zjištění počtu CFU po předchozí sonikaci, obarvení a spektrofotometrie, kolimetrie – resazurin, konfokální mikroskopie, . . . ) q Genotypové metody (PCR)
Diagnostika biofilmu (2) �Minimální inhibiční koncentrace (MIC) platná pro planktonní buňky neodpovídá koncentracím schopným zasáhnout biofilm. �MBIC – minimální biofilm inhibující koncentrace. �MBEC – minimální biofilm eradikující koncentrace. �Hodnoty MBEC leží často nad break pointem pro daná ATB. �Rozdíly v citlivosti MBEC vs. MIC jsou až několik řádů.
Rozdíly v citlivosti MIC, MBEC
Orální biofilm
Úkol 1: Mikroskopie orálního biofilmu
Úkol 2: Vliv čištění zubů na orální biofilm �Po obarvení biofilmu jodovým roztokem (cca 2 min) �Zapište, kde se nachází nejvíce biofilmu
Úkol 3: Průkaz mikrobů kolonizujících katétry (1) � Kvalitativní pomnožení v bujonu: citlivé, ale nelze rozlišit kolonizaci od kontaminace metoda se nedoporučuje. Negativní výsledek vylučuje kontaminaci. � Semikvantitativní metoda (Makiho metoda): katétr je válen po povrchu agaru sterilní pinzetou – Pro krátce zavedené katétry vnější kolonizace q Pro déle zavedené katétry nevhodné, kolonizace je především zevnitř q Kolonizace při >15 koloniích q Sonifikační metoda: katétry sonifikovány v ultrazvukové vaně, uvolněné bakterie jsou následně kvantifikovány vyočkováním na krevní agar zjišťuje se počet CFU. Hranice pozitivity: > 100 (1000) CFU
Úkol 3: Průkaz mikrobů kolonizujících katétry (2) �Porovnejte jednotlivé metody a rozhodněte o možné kolonizaci katétru. �kvalitativní metoda �semikvantitativní metoda ( >15 CFU) �sonifikace katetru (>100 CFU)
Úkol 4: Vliv přítomnosti sacharidů na dynamiku růstu biofilmu �Vyplňte přibližný průměr hodnot absorbance do tabulky a sestrojte prostorový graf; učiňte závěr o množství přidané glukózy a růstu biofilmu S. mutans.
Úkol 5: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k ATB �zákal/žluté důlky znamenají růst mikrobů �odečtěte hodnoty MIC (planktonická forma) a MBEC (biofilm) �porovnejte hodnoty mezi sebou
Úkol 6: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k fágovému preparátu (1) � Nutné najít alternativní způsoby terapie. Jednou z možností je léčba pomocí bakteriofágů plaková metoda (metoda dvouvrstevného agaru). � Postup: q rozvařte (cca 15 min. ) 2, 5 ml 0, 7% masopeptonového agaru (MPA) a temperujte na 42 °C q vytvořte suspenzi Staphylococcus aureus v 0, 7% MPA q suspenzí přelijte misku s 1, 5% MPA a nechte ztuhnout na Petriho misku kápněte 10– 20 μl fágového preparátu STAFAL q odečtěte předpřipravený výsledek testu (váš test by se nyní inkuboval)
Úkol 6: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k fágovému preparátu (2)
Úkol 6: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k fágovému preparátu (3)
Po tomto cvičení byste měli: �Vědět, �Znát co je biofilm a kde se s ním můžete setkat. vznik biofilmu. �Umět popsat obtíže a terapii infekce způsobené biofilmovými společenstvi.
- Slides: 31