Biodegradcis bioremedicis eljrsok bemutatsa II RSZ FEHRJE s

Biodegradációs, bioremediációs eljárások bemutatása II. RÉSZ FEHÉRJE- és SZÉNHIDRÁTPOLIMEREK

Fehérjék és bontásuk Fontosabb fehérjék: • • • albuminok (szérumalbumin, ovalbumin, laktalbumin) globulinok (szérumglobulin, fibrinogén, aktin, miozin) prolaminok, glutelinek (gliadin) hisztonok, protaminok szkleroproteinek (fibroin, kollagén, keratin) összetett fehérjék: foszfo-, kromo-, gliko-, lipo-, nukleoproteinek

Fehérje, mint hulladék • Élelmiszer ipar fejlődésének eredményeként • Nem toxikus, de magas szervesanyag tartalma miatt veszélyes hulladéknak minősül • Ált. nem hosszútávú probléma, kivétel vízben nem oldódó polimer formái, főleg keratin • Naponta nagy mennyiségben keletk. Keratin alapú hulladék (toll, szőr) – Kémiai megsemmisítés: savas hidrolizis – Biológiai megsemmisítés keratináz enzimmel • Potenciális szerves tápanyag (biomassza) takarmányokba, fermentációs alapanyagként érdemes hasznosítani

Toll, szőr • A testsúly 5 -7%-át is elérő mennyiségben jelenlévő, védő funkciót ellátó képletek szerkezetüknek stabilnak, ellenállónak kell lennie • Biotechnológiai szempontból érdekesek és fontosak, mivel potenciális tápanyagok, hiszen fehérje polimerek - keratin -, így aminosavak építik fel • Hátrányuk, hogy nehezen emészthetők, valamint minimális mennyiségben van jelen bennük néhány esszenciális aminosav pl. : metionin, lizin, hisztidin és triptofán • Az aminosav összetétel változik az állat korával

Keratin szerkezeti felépítése Vízben oldhatatlan fehérje, ellenálló a legtöbb proteolitikus (keratinolitikus) enzim aktivitással szemben A kiemelkedő haj/szőr rostok a kortikális sejtekből állnak, melyeket a kb. 10 nm-es keratin filamentek és az azokhoz kapcsolódó mátrix tölt ki. A keratint felépítő fehérjék csoportosítása: Ø glicin-tirozin gazdag fehérjék (főleg a filamentek közötti mátrixban) Ø alacsony kéntartalmú fehérjék (filamenteket alkotják) Ø magas kéntartalmú fehérjék (mátrixban) A fehérjékből felépülő filamentumok között, a nagyszámú cisztein aminosavaknak köszönhetően kénhidak jönnek létre. A polipeptidek között kialakuló hidrogén kötések és hidrofób kölcsönhatások, valamint a szupercsavart szerkezet stabilitása felelős a nagyfokú rezisztanciáért.

Hidrofób- és van der Waals kölcsönhatások Polipeptid váz Hidrogén kötés Diszulfid híd Ionos kötés

KERATIN BONTÁSA MIKROORGANIZMUSOKKAL Ø A mikrobiális lebontó folyamat lassú a természetben Ø A nagy kéntartalom következtében csak kevés mikroorganizmus képes a keratin alapú hulladékokat hasznosítani – dermatofita gombák képesek szén- és nitrogénforrásként hasznosítani. Azóta számos mikroorganizmust azonosítottak, melyek hasznosítják a keratint: szaprofita- ill. parazita gombák, sugárgombák, baktériumok Ø Az iparban nagy mennyiségben keletkező keratin alapú hulladék gyors eltávolítására van szükség Ø A fehérjék egyik leggyakoribb, és legfontosabb enzimatikus módosítása a peptidkötések proteolitikus hasítása PROTEÁZOK

Poliszaharidok

Általános jellemzésük • Poliszaharidok vagy glükánok sok monoszaharid egységből felépülő óriás molekulák • Vízben nem oldódnak, vagy ha igen oldatuk kolloid tulajdonságokat mutat • A legelterjedtebb természetes eredetű szénvegyületek • Állatok, növények, mikroorganizmusok sejtjeiben különféle szerkezetű poliszaharidok, funkciójuk szerint váz-, tartaléktápanyag szénhidrátok

Keményítő A keményítő – poliszaharid növényi tápanyagraktár felépítése: D-glükóz - a(1 4) kötés - lineáris homopolimer (amilóz) és - elágazó homopolimer (amilopektin) keverék - hidrogénkötések erősítik a polimert - Az amilopektin elágazásainak mértéke és az amilóz : amilopektin arány a keményítő „korától” és származásától függ vízben oldódva kolloidális oldatot képez, s így enzimatikusan bontható Ipari alkalmazás: élelmiszer- és szeszipar (fruktóz-, glükóz ill. alkohol gyártás) Keményítőt hasító enzimek: α-amiláz, glükoamiláz, glükóz izomeráz

Amilázok a-amiláz (α-1, 4 -D-glükán-glükonohidroláz): – Endoenzim, véletlenszerűen hasítja a polimert, oligoszaharidok keletk. , a hosszabb láncokat könnyebben bontja – extracellulárisan fejti ki hatását, termék gátlás (glükóz) – Ca igény – Hasznosítása: alkohol termelés, keményítő bontás – Termelő fajok: Aspergillus niger, Bacillus subtilis, B. licheniformis, de megtalálható a nyálban, hasnyálmirigy is termeli, növényekben is – A kül. eredetű enzimek sok tul-ban hasonlóak, de el is térnek egymástól (p. H, hőm. opt) · b-amiláz: – nem redukáló láncvégekről hasít le maltózt – Stabilabb, nincs Ca igénye – Egyes Streptomyces, Pseudomonas fajokban, növényekben • Glükoamiláz: – elágazásoknál hasít, de mindhárom féle hasítrásra képes – Termelő fajok: Aspergillus niger • Pullulanáz (izoamiláz): – amilopektin elágazódásainál, az a-1, 6 -kötéseit hasítja – Termelő fajok: Pullularia pullulans ·

A keményítő szerkezete, és enzimatikus hasítása a-amiláz először oligoszaharidokra bontja (dextrinek) b-amiláz a láncvégi nem redukáló csoportoknál hasít le maltóz molekulákat

A fruktóz és alkohol ipari előállítása keményítőből 1. 2. 3. 4. 5. Őrölt gabona keményítőjét gőz és nyomás segítségével gélesítik Lehűtik 50 -60°C-ra és α-amilázt adnak hozzá, mely az α-1, 4 -kötéseket elhasítja rövidebb poliszaharid szálak Glükóz felszabadítása glükoamiláz enzimmel végtermék: glükóz Glükóz izomeráz hozzáadásával fruktózt állíthatunk elő Élesztő sejtek hozzáadásával a glükózból alkohol fermentálható α-amilázt főleg Bacillus-ok termelik, extracelluláris Glükoamiláz termelő pl. Aspergillus niger

Ciklodextrinek • A keményítő amilóz komponenséből képezhető gyűrűs oligoszaharidok (B. macerans glükozil transzferáz) • Szerkezetüknek köszönhetően „molekuláris csomagolóanyagként” hasznosíthatók gyógyszeripar-, de mezőgazdaság-, élelmiszeriparban is • Biodegradáció szempontjából a jelentősége az, hogy bizonyos anyagok hozzáférhetőségét javítja, nehezen oldódó vegyületeket kolloidális állapotba juttatva bonthatókká válhatnak

Glikogén • Emberi, állati eredetű tartalék tápanyag • Szerkezete hasonló a keményítőhöz • Biodegradációs szempontból szerepe élettanilag nagy, de hasznosítás, ipari alkalmazás szempontjából nem jelentős Dextránok • Jellegzetes baktérium eredetű un. tokanyag poliszaharidok • Szerkezetére a D-glükóz részek a(1 6) kötése jellemző, néhol láncelágazódást is megfigyeltek • Mesterségesen térhálósított alakja a Sephadex • Biodegradáció szempontjából nem jelentősek

Glikolipidek (lipopoliszaharidok), glikoproteinek • Sejteket határoló membránokban • Jelentőségük a biodegradációs eljárásokban jelentős lehet, mint felületaktív anyagok Néhány mikroorganizmus képes az extracelluláris terébe kijuttatni e molekulákat, melyek a vízben nem, vagy rosszul oldódó anyagokkal micellákat képezve a szerves tápanyagokat hozzáférhetővé teszik a mikroorganizmusok számára

Cellulóz – a legelterjedtebb polimer molekula a bioszférában (a növények sz. súlyának 30 -35%-a) – hosszú lánca D-glükóz molekulák β-1, 4 -es kapcsolatából épül fel – a cellulózban a glükóz láncok úgy helyezkednek el, hogy egy kristályszerű szerkezetet tudnak létrehozni, ami vízhatlan – oldhatatlan, és ellenáll a hidrolízisnek – a növényekben támasztó-szerkezeti molekula (lignocellulóz) – a legegyszerűbb komponens a lignocellulózban – Hidrogén hidak is kialakulnak

Cellulóz • Hasznos szénforrás, ezért iparilag hasznosítani kellene • Első lépés: ki kell hámozni a lignin-hemicellulóz takaróból, ezek után jöhetnek a cellulázok: - endoglükanáz - exoglükanáz - cellobiohidroláz - β-glükozidáz, v. cellobiáz • Biogáz, bioetanol ellőállításban egyre nagyobb szerep!

cellulázok • Enzimrendszer: endo-, exocellulázok, b-glükozidázok – Extracelluláris, ill. sejtek felszínén – Termelő fajok: Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Clostridium, Cellulomonas fajok – Endocelluláz: random hasít oligomerekre – Exocelluláz: láncvégről dimereket – cellobióz- hasít – b-glükozidáz: cellobiózt kettéhasítja glükózokra

Cellulóz és hasító enzimei

Cellulóz bontó mikroorganizmusok • Széles körben elterjedt e képesség a baktériumok és eukarióta gombák körében • 1970 -es évek: olajválság megújuló energiaforrások kutatása (cellulózból etanol és más hasznos vegyület előállítása) • Pl. Trichoderma gombák - egyedi enzimek dolgoznak egymással szinergizmusban (aeroboknál általában igaz) - Trichoderma reesei • termofil Clostridiumok (Gram pozitív, obligát anaerob bakt. ) C. thermocellum, C. cellulolyticus • Kevés kivétellel az anaerob bakt. un. policelluloszóma organellunokba szervezik celluláz enzimeiket

Celluloszóma Ø sok van a sejt felszínén és extracellulárisan is Ø nagy molekula, kb. 2000 k. Da, extracellulárisan rakódik össze Ø extracelluláris szupramolekuláris komplex, ami hatékonyan bontja a cellulózt és más sejtfalkomponenseket (glikozidos kötéseket) Ø nagy celluláz-aktivitás Ø az enzimösszetételt valószínűleg a szubsztrát is befolyásolja Ø a csapatmunka hatásosabb: kevesebb enzim elég ugyanannyi kristályos cellulóz szolubilizálásához (szinergizmus), míg a szabad enzimek könnyebben eldiffundálhatnak Ø a C. thermocellum (celluloszóma) hatékonyabb a Trichoderma reeseinél (egyedi enzimek) Ø mesterséges celluloszómák: mesterséges polimerek lebontása (nejlon, poliészter, műanyagok), válogatott enzimek meghatározott helyre beépítve

Nem celluloszómás cellulázok • A termelő fajok gyakran több hasonló funkciójú cellulázt termelnek, melyek specifitása némileg eltér (a polimert másmás helyen hasítják) • Pl. T. reesei két exoglükanáz, 5 endoglükanáz. Cellulomonas sp. 6 endoglükanáz • Ezek az enzimek rendelkeznek cellulóz kötő doménnel • Thermobifida fusca faj érdekessége, hogy van egy olyan glükanáza, mely endo-, és exo aktivitással is bír

Hasznosítás • • • Papírgyártás, biogáz, bioetanol előállítás Növényi eredetű hulladék nagy mennyiségben keletk. a növények feldolgozása során Nem tisztán cellulóz, hanem lignocellulóz formájában: A lignin, hemicellulóz, cellulóz polimerek különböző kombinációja (növények szerkezeti felépítésében alapvető)

Lignocellulóz alkotó komponensei • Lignin: – 3 D, globuláris, szabálytalan, nem oldható, nagy molek. s. polimer – fenilpropán alegységek- különböző kémiai kötésekkel kapcs. – kémiai kötésekkel kapcsolódik a hemicellulózhoz is, és a cellulóz szálakat beburkolja – felelős a növény rigiditásáért, a mechanikai behatásokkal és mikroorganizmus támadásokkal szembeni ellenállóképességért • Hemicellulózok: – rövid láncú, heterogén polimerek - hexózokat (pl. glükóz, mannóz, galaktóz), pentózokat (xilóz, arabinóz) tartalmaznak – három fő csoport: a, xilánok b, mannánok c, arabinogalaktánok

Reprezentatív lignin szerkezet - a fenilpropán egységek kapcsolódása nem szervezett, nem ismétlődő O CH C C C 2

Reprezentatív xilán szerkezet, és hasító enzimei Xilán az egyik leggyakoribb poliszaharid a term-ben, a cellulóz és lignin szálak között kovalens ill. hidrogén kötésekkel kapcs. Papíripar számára hátrány

Etanol előállítás lignocellulózból

Kitin • Rovarok, rákok-ban váz poliszaharid, megtalálható gomba sejtfalban • Vízben, híg savban, lúgban nem oldódik • Tömény savval is csak nehezen hidrolizálható melegítéssel N-acetil-glükózamin, majd ecetsav és D-glükóz keletkezik • Felépítése: N-acetil-D-glükózamin részek b-glikozid (1 -4) kötéssel kapcsolódnak • Enzimes hasítása kitinázzal, mely egyes baktériumokban, gombákban, néhány növényben fordul elő • Derivátja a kitozán Kitin szerkezeti részlet

Pektinek • Növényekben, főleg gyümölcsökben (citrus félék, alma, szeder, ribizli –ben sok), savas karakterű • Legjellemzőbb a poligalakturonsav előfordulása, melyben a D-galakturonsav részek a(1 4) kötéssel kapcsolódnak, ezt a kötést pektináz enzimmel lehet hasítani • Minor komponensként rhamnóz előfordul a(1 2) kötéssel, valamint neutrális cukrok, pl. arabinóz, galaktóz, xilóz, a galaktironsav metilált lehet • Iparban gélesítő ágens (pl dzsem készítéshez) • Pektináz jelentősége: élelmiszeripari hasznosítás (gyümölcslé) Sejtfal szerkezet

COOH OH O COOH Poligalakturonsav részlet Elágazások lehetnek a pektinben

Pektin gélesedése Ca ionok hatására Poligalakturonát

Lipidek • Elterjedtek: növényekben a magvak súlyának akár 50%-a, állatvilágban pl. méhek viasz termelése, tengeri élőlények túléléshez fontos a zsiradék • Lúgokkal kezelhetjük, de biológiai bontása enzimatikusan észterázok, lipázok • Bontás eredménye glicerin és zsírsav • Hulladékként a szennyvizek elvezető csatornáiban komoly gondot okoznak, eltömődések, ill. gátolják az oxigén transzfert • Biodegradációt gátolja, hogy nem oldódnak vízben, így biohozzáférés korlátozott • Biodegr elősegítése pl. felületaktíva. v. oldószer adagolás

Észterázok, lipázok • Észterkötések hidrolizise: glicerinészterekből zsírsav és glicerid • Extracelluláris, ált. gyengén lúgos környezetben, Ca ionok pozitív hatás (zsírsavak Ca sóként kicsapódnak, nincs termékgátlás) • Indukálhatóak, az enzim termelésre a N forrás is hatással van • 3 féle mikrobiális lipáz: 1. nem specifikus, 2. régióspecifikus, 3. zsírsav specifikus lipázok • Hasznosítás: gyógyászat, élelmiszeripar (pl. sajtgyártás), tisztítószerek, bioüzemanyagok (biodízel) • Termelő fajok: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, egyes élesztőgombák, és Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Micrococcus baktériumok, emlős hasnyálmirigy, máj, magvakban