Biodegradazione anaerobica di alcani p esadecano Degradazione anaerobica

Biodegradazione anaerobica di alcani (p. esadecano)

Degradazione anaerobica di composti aromatici Composti aromatici a basso PM possono essere il substrato di crescita di molti batteri anaerobici Passaggio chiave del processo di degradazione anaerobica è la riduzione dell’anello aromatico che porta alla perdita di aromaticità Come nel metabolismo aerobico, anche in quello anaerobico esistono dei pathways periferici che trasformano tutti i composti aromatici in pochi intermedi che fanno parte di un pathway centrale. L’enorme varietà di substrati aromatici viene trasformata in pochi intermedi centrali facilmente riducibili Fluoroglucinolo – Ha debole carattere aromatico ed è enzimaticamente ridotto con NADH Resorcinolo – Ha maggior carattere aromatico. Viene ridotto da riducenti piu’ potenti (ferredossina) Benzoil-Co. A, un tioestere con forte carattere aromatico, viene ridotto con ferredossina, in presenza di ATP

Reazioni di dearomatizzazione in pathways aerobici e anaerobici acido gentisico acido protocatecuico benzoil. Co. A floroglucinolo resorcinolo

Pathways periferici La degradazione anaerobica degli aromatici avviene, attraverso pathways periferici, trasformando i composti in intermedi centrali che sono benzoil. Co. A resorcinolo floroglucinolo

Pathways periferici

Co. A

Altri intermedi centrali di pathways anaerobici Oltre al benzoil. Co. A altri intermedi centrali dei pathways anaerobici sono: resorcinolo floroglucinolo Hanno scarsa aromaticità e possono essere facilmente ridotti. Gli enzimi che riducono resorcinolo e floroglucinolo sono meno complessi della benzoil. Co. A riduttasi e non richiedono energia per la riduzione dell’anello

Le vie del floroglucinolo e del resorcinolo Non necessitano di attivazione per essere ridotti Floroglucinolo riduttasi L’enzima è stato isolato e purificato da Eubacterium oxidoreducens, in forma solubile e omodimera (MW 78000). 1, 3 diosso-5 -idrossi-cicloesano Resorcinolo riduttasi E’ sensibile ad O 2 e non necessita di nucleotidi piridinici, ma viene ridotto da una ferredossina. E’ specifico per resorcinolo e suoi analoghi Il prodotto viene idrolizzato subito a 5 -ossoesanoato 1, 3 -diosso-cicloesano Resorcinolo idratasi E’ la via di degradazione seguita da A. denitrificans. L’enzima catalizza l’idrolisi diretta del resorcinolo senza riduzione dell’anello aromatico 5 -osso-esa-2 -enecarbossilato

Il pathway centrale da resorcinolo e floroglucinolo a acetil-Co. A riduttasi (NADPH) 1, 3 diosso-5 -idrossicicloesano 1, 3 diosso-cicloesano -ossid. idrolasi 3 -idrossi-5 ossoesanoato deidrogenasi (NADP+) 3, 5 -diossoesanoato acetil-Co. Atriacetato-Co. A transferasi triacetil-Co. A - chetotiolasi 5 -osso-esa-2 ene-carbossilato 5 -osso-esanoato -ossid.

Riduzione enzimatica dell’anello aromatico L’enzima catalizza il trasferimento di 2 elettroni dalla ferredossina ridotta al benzoil Co. A. formando cicloesa-1, 5 -diene-1 -carbossil-Co. A. C 6 H 5 -CO-SCo. A + 2 Mg. ATP + 2 e- + 2 H+ + 2 H 2 O C 6 H 7 -CO-SCo. A + 2 Mg. ADP + 2 Pi riduttasi benzoil-Co. A In R. palustris il prodotto è cicloesa-1, 5 -diene-1 -carbossil-Co. A riduttasi cicloesa-1, 4 -diene-1 -carbossil-Co. A

Riduzione enzimatica dell’anello aromatico L’enzima che riduce il benzoil Co. A è una riduttasi. E’ stata isolata da R. palustris e da Thauera aromatica PM 160000, tetramero costituito da 4 subunità diverse (a, MW 49000, b, MW 48000, c, MW 44000, d, MW 29000) con alta omologia tra i vari organismi (25 -70%). Contiene 3 cluster Fe 4 S 4. Le subunità a e d contengono ciascuna un motivo di legame per l’ATP. Sulla base del confronto con un enzima simile (attivasi/deidratasi da Acidaminococcus fermentans) che catalizza l’eliminazione di una molecola di acqua da idrossi Co. A tioesteri, di cui è nota la struttura, sono fatte ipotesi sulla struttura e sul meccanismo di reazione della riduttasi. Si ipotizza che un cluster sia legato a ponte tra le subunità a e d. Le altre subunità legherebbero il benzoil Co. A e gli altri 2 cluster.

Riduzione enzimatica dell’anello aromatico La reazione di riduzione è accoppiata all’idrolisi dell’ATP. Benzoil-Co. A riduttasi catalizza lo scambio isotopico da 14 C-ADP a ATP suggerendo la formazione di un intermedio dell’enzima fosforilato. In assenza di substrato riducibile la riduttasi nella forma ridotta mantiene attività ATPasica. Uno dei cluster [4 Fe-4 S]+1 ridotti passa dallo stato basso spin S=1/2 all’alto spin S=7/2. L’energia rilasciata dall’idrolisi del legame fosforico dissipata come calore. In presenza di substrato gli elettroni attivati sono trasferiti all’anello benzenico

Riduzione dell’anello aromatico E°(1 a) = -3. 15 V E°(2 a) = -1. 8 V E° (1 b) = -0. 25 V Vantaggi della riduzione biologica del benzoil. Co. A La reazione viene catalizzata dalla benzoil. Co. A riduttasi. La parte nucleotidica del Co. A facilita il legame del substrato e assicura la corretta posizione dell’acido aromatico nel centro attivo dell’enzima La presenza del gruppo –CO-SCo. A innalza il potenziale di riduzione (E° (2 a) = -1. 8 V) L’enzima che catalizza questa reazione (benzoil. Co. A riduttasi) richiede tuttavia energia per fare avvenire la reazione

Birch Reduction

Meccanismo della benzoil-Co. A riduttasi cicloesa-1, 5 -diene-1 carbossil-Co. A La reazione della benzoil-Co. A riduttasi procede attraverso 2 reazioni successive, monoelettroniche Il radicale anione generato nel primo step viene stabilizzato dall’uptake di un protone Segue una seconda riduzione e protonazione

Sorgente di elettroni per la riduzione enzimatica Gli elettroni vengono trasferiti alla benzoil-Co. A riduttasi da una ferredossina (PM 9000, 2 clusters Fe 4 S 4 (E° = -435 m. V, E° = -585 m. V). La ferredossina viene ridotta da 2 -oxoglutaril: ferredossina riduttasi e fa da shuttle di elettroni tra il ciclo dell’acido citrico e la riduzione enzimatica dell’anello del benzene Electron transfer from 2 -oxoglutarate to the aromatic ring catalysed by 2 -oxoglutarate: ferredoxin oxidoreductase and benzoyl-Co. A reductase. Note that three molecules of 2 -oxoglutarate are formed per molecule of benzoyl-Co. A reduced. However, oxidation of one molecule acetyl-Co. A would be sufficient to the provide electrons required for the reduction of one molecule benzoyl-Co. A. The surplus of reduced ferredoxin is suggested to be chaneled to NAD+, catalysed by ferredoxin: NAD+ oxidoreductase.

Pathway centrale da benzoil-Co. A a acetil -Co. A e CO 2 cicloesa-1, 5 -diene-1 carbossil-Co. A crotonil-Co. A ox glutaril-Co. A -ox 3 -idrossipimelil-Co. A Ossidazione di cicloesa-1, 5 -diene-1 -carbossil-Co. A produce 3 molecole di acetil-Co. A e 1 molecola di CO 2 Acetil-Co. A può essere ossidato via -ciclo acido citrico - ciclo del gliossilato

Reazioni metaboliche periferiche Attivazione di acidi aromatici in Co. A-tioesteri La reazione è catalizzata da Co. A ligasi la cui sintesi è legata alla presenza del substrato La formazione del Co. A tioestere permette di attivare l’anello aromatico ed è essenziale per l’ulteriore conversione Tutte le Co. A ligasi richiedono Mg. ATP (talvolta Mg può essere sostituito da Mn e ATP da CTP) e Co. A Gli isoenzimi si differenziano per la diversa specificità degli acidi aromatici L’acido aromatico viene prima attivato come aciladenilato e poi trasferito al gruppo tiolico del Coenzima A E + Mg. ATP + RCOOH [E: : R-CO-PAdo + Co. ASH [E: : R-CO-PAdo +Mg + PPi R-CO-SCo. A + AMP + E AMP, gruppo adenilico

Reazioni metaboliche periferiche Carbossilazione di composti fenolici o anilinici L’anello aromatico viene carbossilato in posizione para rispetto ad uno degli OH sull’anello La carbossilazione avviene in 2 steps: 1) Fosforilazione del substrato + X-PO 32 - fenolo chinasi + X-H 2) Carbossilazione del fenilfosfato a 4 -idrossibenzoato + CO 2 + H 2 O fenilfosfato carbossilasi L’idrossibenzoato viene poi attivato da Co. A ligasi. Il Co. A-tioestere viene poi deidrossilato a benzoil. Co. A + H 2 PO 4 -

4 -idrossibenzoato + 14 CO 2 [14 C]4 -idrossibenzoato + CO 2

Reazioni metaboliche periferiche Deidrossilazione riduttiva In condizioni aerobiche la presenza sull’anello aromatico di gruppi OH è necessaria per la rottura dell’anello. In condizioni anaerobiche l’OH deve essere rimosso per trasformare il substrato in benzoil-Co. A, intermedio centrale La reazione è una deidrossilazione riduttiva + 2 e - + 2 H+ + H 2 O L’enzima, 4 -idrossibenzoil-Co. A-riduttasi, isolato da Thauera aromatica, è costituito da 3 diverse subunità di PM 75000, 35000, 17000 ( 2 2 2). Contiene 2 centri Fe 2 S 2 2 centri Fe 4 S 4 Mo Flavina La reazione avviene in 2 step monoelettronici

Mo, cyan; Fe, magenta; S, green; O, red; N, blue; C, yellow.

Substrate Binding Site 4 -OHBCo. A is modeled into a 6 Å wide channel in such a way that the Mo-ligated water is replaced by the hydroxy group of 4 -OHBCo. A. The benzoyl moiety is flanked by four aromatic residues comprising Tyrα 319, Tyrα 326, Hisα 360, and Tyrα 521 (surface colors: blue, basic; red, acidic; cyan, polar; green, aromatic; yellow, aliphatic).

Reazioni metaboliche periferiche Deamminazione riduttiva Gruppi amminici vengono rimossi in modo analogo ai gruppi OH. Sono cattivi “gruppi uscenti”. La tioesterificazione facilita la riduzione dell’anello e la seguente eliminazione di NH 3. L’enzima responsabile della reazione non è stato isolato +2 e- + 2 H+ + NH 3 Dealogenazione riduttiva La dealogenazione riduttiva avviene senza attivazione del substrato. Infatti gli alogeni sono gruppi uscenti migliori di –OH e NH 2. L’enzima 3 -clorobenzoato dealogenasi da Desulfomonile tiedjei è stato isolato E’ un enzima di membrana, costituito da 2 subunità (PM 64000, 37000). Contiene un eme c nella subunità più piccola + 2 e- + 2 H+ + Cl-

Reazioni metaboliche periferiche -ossidazione di gruppi carbossimetile Fenilacetato e idrossi-fenil acetato si formano nella degradazione di alcuni acidi grassi, di fenilalanina, di tirosina e di monomeri della lignina In condizioni anaerobiche possono essere degradati attraverso un meccanismo di -ossidazione. Questo è preceduto da una Co. A-tioesterificazione che facilita l’ -ossidazione. Fenil-acetil-Co. A è ossidato a fenil-gliossilato da un sistema enzimatico che catalizza l’ossidazione a 4 elettroni. + 2 H 2 O -ossidazione + 4 e- + 4 H+ + Co. ASH fenil-gliossilato L’enzima fenilgliossilato ossidoriduttasi catalizza la decarbossilazione ossidativa Co. A dipendente del fenilgliossilato a benzoil-Co. A + 2 e- + H+ + CO 2 + Co. ASH benzoil-Co. A

Reazioni metaboliche periferiche Ossidazione di gruppi metile Due diversi pathways degradativi possono essere seguiti in condizioni anaerobiche Ossidazione del metile attraverso reazione di idrossilazione E’ il meccanismo seguito nella degradazione del p-cresolo da parte di batteri denitrificanti. Porta alla formazione di 4 -idrossibenzaldeide H 2 O + 2 e - + 2 H+ Condensazione con fumarato La reazione è catalizzata dall’enzima benzil-succinatosintasi + Il benzil-succinato viene poi ossidato a benzoil-Co. A

Condensazione con fumarato: benzil succinato sintasi: una via radicalica per l’attacco di un substrato non reattivo L’enzima è stato identificato in batteri denitrificanti e presenta una subunità (MW 98000) che contiene un radicale glicina, oltre a 2 subunità più piccole. La specie radicalica astrae un atomo di H dal toluene, generando un radicale benzilico a cui si addiziona il fumarato. Il radicale benzilsuccinilico viene convertito a benzilsuccinato per trasferimento di un atomo di H dall’enzima

Catabolismo anaerobico del toluene

Toluene: Aerobic degradation Degradation is initiated by either a mono- or dioxygenase.

Toluene: Anaerobic degradation Conjugation of fumarate to toluene gives benzylsuccinate Benzylsuccinate is converted via a -oxidation-like process to give benzoate (benzyl-Co. A). Benzoate is further metabolized

Proposed pathway for the degradation of ethylbenzene in the sulfate-reducing strain Eb. S 7. A, ethylbenzene; B, (1 -phenylethyl)succinate; C, (1 -phenylethyl)succinyl. Co. A; D, (2 -phenylpropyl)malonyl-Co. A; E, 4 -phenylpentanoyl-Co. A; F, 3 -oxo-4 phenyl-pentanoyl-Co. A; G, 2 phenylpropionyl-Co. A. Olaf Kniemeyer et al. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69: 760 -768

Ethylbenzene metabolism in Azoarcus strain Eb. N 1, a denitrifying bacteria (Mo, Fe-S, eme) J Bacteriol. 2005 February; 187(4): 1493– 1503

a Fumarate addition to toluene, and subsequent βoxidation of the intermediate benzylsuccinate to benzoyl. Co. A. Succinate carbons are indicated by red shading. b Hydroxylation of ethylbenzene to 1 phenylethanol, and the ATPdependent carboxylation of acetophenone that is involved in the conversion to benzoyl-Co. A. c The proposed carboxylation of benzene and naphthalene as the initial step of anaerobic degradation. The further metabolic fate of benzene after carboxylation to benzoate appears to be clear, but it is still unknown whether naphthoyl-Co. A is actually metabolized via benzoyl-Co. A (dotted arrow). [ATP] indicates the dependence of the respective reaction on ATP hydrolysis.

Tre diverse vie perifiche fino a benzoil-Co. A A: addizione di fumarato al toluene B: -ossidazione del metile del p-cresolo C: carbossilazione del fenolo

Nature Reviews Microbiology 9, 803 -816, 2011

Regolazione della degradazione anaerobica dei composti aromatici La sintesi degli enzimi coinvolti nella degradazione anaerobica è regolata dalla presenza di O 2 e del substrato. Alcune specie di microorganismi possono crescere aerobicamente o anaerobicamente, tuttavia gli enzimi sintetizzati e i pathways degradativi di un substrato sono diversi L’enzima chiave del pathway centrale della degradazione anaerobica è sempre presente (benzoil-Co. A riduttasi) quando le cellule sono cresciute su substrati aromatici. Gli enzimi dei pathways periferici sono sintetizzati solo se richiesti. I composti aromatici vengono degradati solo quando non sono presenti altri substrati non aromatici. Esistono proteine che presiedono a questi fenomeni di regolazione