Biochimie et Machines Molculaires ATP synthase Une moteur

Biochimie et Machines Moléculaires ATP synthase Une moteur rotatif Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotatif – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Très conservé structure et fonction dans evolution très similaire dans les Archaea, les Eubacteries et le Eucarya. James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotatif – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Deux rôles: tantot fabrication d'ATP grace au gradiant à protons, tantot génération d'un gradiant à protons grace à l'ATP – reversible James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Separation par lavage au sel en une partie membranaire F 0 (ab 2 cn) et une partie soluble F 1 (� ) 3� 3��� Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Interactions electrostatiques. . . James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif F 1 est une ATP'ase . n. H+ P Membrane N ADP + Pi ATP + n. H+ James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif F 0 est un trou a protons . n. H+ P Membrane N ADP + Pi ATP + n. H+ James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● F 1 Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif F 0 James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Toutes les ATP'ase ont des structures très similaires mais il y des petites différences. Plus de sous-unités et variables. Domgall et al. (2002) J. Biol. Chem. , 277: 13115 -13121 James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Toutes les ATP'ase ont des structures très similaires mais il y des petites differences. Architecture semblable mais 3 conections! Domgall et al. (2002) J. Biol. Chem. , 277: 13115 -13121 James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Toutes les ATP'ase ont des structures très similaires mais il y des petites differences. Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Domgall et al. (2002) J. Biol. Chem. , 277: 13115 -13121 James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Trois techniques: Pontage chimique (Cross 1995) PARAP (Junge 1996) Vidéo (Yoshida 1997) Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Pontage chimique Biochimie Introduire des cysteines en �et �. Purifier un complexe ponté ��. Reconsituer avec du � Repurifier des complexes. James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Pontage chimique Biochimie Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Zhou et al. 1997 PNAS 94: 1058310587 James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif PARAP (Junge 1996) Spectroscopie Un colorant Eosine se fixe sur une cysteine de la sous unité �. � -F 1 s'accroche à une bille de CMsepharose. . . Immobile. James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Regarde persistance d'anisotropie apres un eclair, si elle persiste il n-y a pas rotation si elle recupere il y a une rotation. Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Sabbert et al. 1997 PNAS 94: 44014405 James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Plus complexe que BR Les ATP synthase – ● Regarde persistance d'anisotropie après un eclair! Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Sabbert et al. 1997 PNAS 94: 44014405 James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Plus complexe que BR Les ATP synthase – ● Vidéo (Yoshida 1997) Physique Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Noji et al. (1997) Nature, 386: 299 – 302. James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Omote et al. (1999) PNAS, 96: 7780 -7784 James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Capable de beaucoup de force, déplacement d'un énorme filament d'actine. Une torque d'environ 50 p. N nm Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Omote et al. (1999) James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Plus complexe que BR Les ATP synthase – ● Stator et Rotor Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif James Sturgis 1

Introduction ● Les fonctions ● L'architecture – ● Les ATP synthase – ● Plus complexe que BR Thème et variations F et V Un moteur rotative – Preuves – Contraintes Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Stator et Rotor Pontage chimique a definit les deux parties: Rotor �� cn Stator ab 2�� 3� 3 James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique 20Å James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Les sousunités �et � sont très similaires. L'organisatio n générale est six sousunités � 3� 3 autour de la sous-unité �. Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique Les 3 paires de sous-unités �� ont des structures différentes et les �lient des cofacteurs differents. Notamment du site actif! James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Les sousunités �et � serrent la sous-unité �. Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie Les interfaces sont largement hydrophobe (graisse) sauf a milieu et un peu au pied de la sous-unité �. F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique Les trois sites ont des propriétés différentes ●Ouvert: Faible affinité ●Lâche: Plus forte pour ADP et Pi préfère ADP à ATP ●Fermé: Préfère ATP, haute affinité. James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations La sous unité c est très hydrophobe, elle forme deux hélices transmembranaires avec une boucle elle a un résidu acid au milieu de la deuxième hélice transmembranaire. Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie Les sous-unités c s'organisent en anneau F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique Seelert et al. 2000, Nature 405: 418 -419 James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations La sous unité a est membranaire a plusieurs hélices, la sous-unité b est allongée avec une hélice transmembranaire Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie Les sous unités a et b forment un sous complexe F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● F 1 l'ATP'ase – ● ● Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations AB 2 C 10 -14 C anneau B batons A canal à protons Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique Stock et al. (1999) Science, 286: 1700 -1705 James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique Suzuki et al. (2002) J. Biol. Chem. , 277: 1328113285 James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations A) fluorescence d'ACMA B) Activité ATP'asique. Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure Stochiométrie par – Cycle catalytique – Le movie pontage chimique Jones and AFM Fillingame. 1998 J. Biol. Cristallographie Chem. 273: 29701 -29705 F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure Stochiométrie par – Cycle catalytique – Le movie pontage chimique AFM Cristallographie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Seelert et al. 2003 J. Mol. Biol 333: 337 -344 Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure Stochiométrie par – Cycle catalytique – Le movie pontage chimique AFM Cristallographie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Stock, et al. (1999) Science 286: 1700 -1705 Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique Stochiométrie: Mitochondrie – 10 ●E coli – 12 -(ou 10) ●Chloroplaste – 14 + ●Bacterie Na – 11 ● Ilyobacter tartaricus Vonk et al. 2002 J. Mol. Biol 321: 307 -316 Mais est-ce fixe? James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique “Symmetry mismatch” Mesure de rotation de l'holoenzyme Mesures d'elasticité de la jonction Probleme: Comment sont couplés les 10 a 14 protons et les 3 ATP? Il faut stocker les petits rotations (25°-36°) de F 0 avant de faire une grande rotation (120°) de F 1 James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations “Symmetry mismatch” Mesure de rotation de l'holoenzyme Mesures d'elasticité de la jonction Si la connection entre F 0 et F 1 est rigide certains directions seront plus favorable que d'autres. Plus le joint entre les deux est elastique moins 10 on vera cet effet. Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie “Symmetry mismatch” Mesure de rotation de l'holoenzyme Mesures d'elasticité de la jonction F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie “Symmetry mismatch” Mesure de rotation de l'holoenzyme Mesures d'elasticité de la jonction F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie Expérience: une transmission élastique F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique Expérience: une transmission élastique (�� c ou � b) Permet à ce système d'être robust : résister le “mismatch” et rester active en effort. James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons Pourquoi les protons veulent traverser le membrane? Voltage. ∆G = F ∆V Difference de concentration, ∆G = RT ln(H+in/H+out) – Structure et dynamique pmf = F ∆V + 2. 303 RT ∆p. H – Variations ∆V = 100 m. V et ∆p. H = 1 pmf = 9. 65 103 + 5. 74 103 J/mole pmf = 15. 4 k. J/mole Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Combien ca coute a frabriqué une molécule d'ATP? ∆G = ∆G° + RT ln Keq ∆G = ∆G° + RT ln(ATP/ADPx. Pi) ∆G° = +30. 5 k. J/mole typiquement Pi = 25 m. M ∆G = 30. 5+9. 2+2. 5 ln(ATP/ADP) k. J/mol Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons Le moteur calle quand les deux energies sont égales. (F ∆V + 2, 303 RT ∆p. H) * Nb(C) = (∆G° + RT ln(ATP/ADPx. Pi))*3 – Structure et dynamique 15, 4 * 10 = (30, 5+9, 2+2, 5 ln(ATP/ADP))*3 – Variations 4, 65 = ln(ATP/ADP) Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique Le moteur calle quand les deux energies sont égales. (F ∆V + 2. 303 RT ∆p. H) * Nb(C) = (∆G° + RT ln(ATP/ADPx. Pi))*3 Se moment depend de la force protonmotrice, si elle diminue l'ATPsynthase arrete et devienne eventuellement une ATP'ase (type. V) James Sturgis 1

Fonction ● ● ● F 1 l'ATP'ase – Structure – Cycle catalytique – Le movie Dans certains cas ils existent peutetre des protéines “cliquet” qui evite que l'ATP synthase devienne une ATP'ase. F 0 une turbine à protons – Structure et dynamique – Variations Couplage mécanique – Colle – Élastique et Biochimie et– Machines Moléculaires – Un moteur rotatif Energétique James Sturgis 1

Conclusions Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif James Sturgis 1

Conclusions Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif James Sturgis 1

Reférences – Bibliographie Biochimie et Machines Moléculaires – Un moteur rotatif James Sturgis 1