BIFC Bimolecular Fluorescence Complementation Alba Espargar Colom Protein

BIFC Bimolecular Fluorescence Complementation Alba Espargaró Colomé

Protein Fragment Complementation o També anomenats: Interaction trapping. o Permeten observar interacció entre proteïnes in vivo. o Classes: o o Ubiquitina Dihidrofolat reductasa Β-galactosidasa GFP (green fluorescent protein)

o Detection of transient protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation: The Abl-SH 3 case M. Morell et al. Proteomics 2007, 7, 1023 -1036 Estudiar en detall la habilitat del mètode BIFC per detectar interaccions transitòries.

The Abl-SH 3 case Domini SH 3: Domini implicat en la regulació negativa de l’activitat quinasa mitjançant interaccions transitòries entre proteïnes. o C-Abl tyrosine kinase: regula diferenciació cel·lular i apoptosi, sent responsable de molts senyals extracel·lulars (factors de creixement, adhesió cel·lular i citoquines) i intracel·lulars (dany DNA, estrès oxidatiu)

Interaccions estudiades o Domini SH 3 interacciona amb polipèptids rics en prolina, seguint el motiu PXXP: o o o BRCA 1: càncer de mama tipus 1 PRDX 1: peroxiredoxina p 41: pèptid ric en prolina + mutants o o o WT (Tyr 4) Tyr 4 Arg Tyr 4 Phe Tyr 4 Trp Tyr 4 Gly

Bimolecular Fluorescent Complementation

o C-Abl-SH 3: fusionada a l’extrem C-terminal (156 -238) amb un linker de seqüència SGGGSGGS i clonada en p. BAT-4 (amp. R) o Pèptid p 41: fusionat a l’extrem N-terminal (1155) amb un linker de seqüència SGGGS i clonat en p. ET 28 -a(+) (kan. R) Transformació de cèl·lules competents d’Escherichia coli BL 21(D 3)

Esquema basat en les estructures obtingudes per X-ray

Experiments amb p 41 o Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH 3 -CYFP o pp 41 -NYFP individualment. Fragments individuals de YFP no són funcionals

o Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH 3 -CYFP i p-p 41 -NYFP La majoria de les cèl·lules tenen fluorescència. o Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH 3 -CYFP i p-NYFP Necessitat de dues proteïnes per la reconstitució de YFP

o Anàlisi de l'espectre d’emissió de fluorescència on s’observa el pic a 523 nm, l’espectre característic de la YFP nativa

Estructura de Abl-SH 3 interaccionant amb P 41 o Pro 54 i Trp 36 són dos residus molt ben conservats en el domini SH 3, situats en el centre hidrofòbic. o Juga un paper molt important en la interacció amb els pèptids rics en prolina. o Pro 54 Leu redueix significativament la unió del domini Abl-SH 3 amb els lligands

Contrast de fases (esquerra) i fluorescència (dreta)

Western blot: (1) c-Abl-SH 3 -CYFP (2) C-Abl-SH 3 -P 45 L-NYFP

Mutants de p 41 o Construcció de 5 mutants de p 41 en la posició 4 (important per la interacció amb Abl-SH 3) o o Trp 4, Phe 4, Tyr 4, Arg 4 i Gly 4 Es va transformar amb una barreja dels 5 a igual concentració juntament amb c-Abl-SH 3 -CYFP

Western Blot Tyr>Arg>Phe>Gly>Trp

Estabilitat de la reconstitució de la YFP Una vegada YFP està reconstituïda és molt estable

Seguiment de les interaccions mitjançant citòmetre de flux o o o 1: 2: 3: 4: 5: control negatiu Abl-SH 3 -CYFP control positiu YFP Abl-SH 3 -CYFP + NYFP Abl-SH 3 -CYFP + p 41 -Gly 4 -NYFP

o Relació en % de Abl-SH 3 -CYFP+p 41 -NYFP / Abl-SH 3 -CYFP+p 41 Gly 4 -NYFP o o o Negre: 20/80 Gris fosc: 10/90 Gris clar: 5/95

o Mitjançant el citòmetre de flux podem observar la presència de bons lligands encara que es trobin a una concentració molt baixa. o Citòmetre de flux és molt ràpid, altament sensible per tant una bona tècnica per avaluar les interaccions transitòries mitjançant BIFC.

Conclusions o BIFC: mètode de visualització directe d’interaccions febles entre proteïnes intracel·lulars. Bon mètode per detectar interaccions fortes però també febles. o No necessita cap assaig enzimàtic per detectar la seva activitat. o L’assaig és suficientment sensible per detectar interaccions entre proteïnes que estan poc expressades en bactèria. o Una vegada els dos fragments de YFP estan units són molt estables, això pot ser la raó de l’elevada sensibilitat, ja que el complex pot emetre fluorescència durant molt temps (setmanes)

Conclusions o Les diferències de fluorescència observades entre els diferents mutants de p 41 determina que és un mètode capaç de diferenciar lligands d’alta i baixa afinitat. o La combinació de BIFC amb el citòmetre de flux fa que sigui un mètode ràpid, altament sensible i selectiu per determinar interaccions febles entre proteïnes o Manera fàcil d’obtenir els resultats.

BIFC Bimolecular Fluorescence Complementation Alba Espargaró Colomé