BI 1 THC NGHIM V PROTEIN I CC

BÀI 1: THỰC NGHIỆM VỀ PROTEIN

I. CÁC PHẢN ỨNG MÀU

1. Phản ứng biure a. Nguyên lý: Trong mt kiềm, các chất chứa từ hai liên kết peptide trở lên sẽ tạo phức chất màu tím hồng với Cu++ (muối đồng) Cơ chế phản ứng:

Protein tạo phức chất màu tím với đồng trong mt kiềm

b. Ứng dụng n n Phát hiện protein Định lượng protein: Dự vào cường độ màu tím. So màu: màu càng đậm, càng nhiều protein.

c. Cách làm + è 1: cho khoảng 0, 1 g ure. Đun trªn ngän löa ®Ìn cån đến khi ure nãng chảy; ®Ó nguéi sẽ ® îc biure. + è 2: 1 ml lßng tr¾ng trøng + è 3: 1 ml dung dÞch gelatin 1% + è 4: khoảng 1 ml sữa t ¬I Thªm vµo mçi èng 1 ml Na. OH 10%, 1 2 giät Cu. SO 4 1%. L¾c ®Òu, quan s¸t, so s¸nh vµ giải thích kÕt quả.

2. Phản ứng xantoprotein a. Nguyên lý: C¸c protein cã chøa aa m¹ch vßng nh : Phe, Tyr, Trp, vv… d íi td cña HNO 3 ®Æc, bị nitơ hóa thành màu vàng, nÕu gÆp m «i tr êng kiÒm m¹nh thì dÉn xuÊt nµy sÏ t¹o thµnh muèi cã màu da cam. Cơ chế phản ứng:

b. Tiến hành Lấy 3 èng nghiÖm èng 1: cho 1 ml dd lòng trắng trứng èng 2: cho khoảng 1 ml sữa tươi èng 3: cho 1 ml dd gelatin 1% Cho tiếp vµo mçi èng 1 ml HNO 3 ®Æc , ®un trªn ®Ìn cån, ®Õn khi xuÊt hiÖn mµu vµng. Sau khi đÓ nguéi, cho tõ tõ tõng giät Na. OH 20% (khoảng 1 2 ml) cho ®Õn khi xuÊt hiÖn mµu vµng da cam. NhËn xÐt vµ giải thÝch kÕt quả.

c. Ứng dụng Ph¸t hiÖn protein trong vËt phÈm KiÓm tra chÊt l îng protein

II. CÁC PHẢN ỨNG SA LẮNG PROTEIN Trong dd, protein ở trạng thái keo bền, nhờ 2 yếu tố: - Sức đẩy tĩnh điện - Lớp vỏ thủy hóa Khi một trong 2 yếu tố trên mất đi, protein sẽ sa lắng.

Lµm mÊt ®iÖn tÝch cña protein b» ng çch : + Đưa p. H cña dd protein vÒ p. H ®¼ng ®iÖn (p. Hi), khi đó ®a sè çc protein ë d¹ng l ìng cùc, kh «ng mang ®iÖn tÝch. + Thªm Na. Cl, (NH 4)2 SO 4…: çc ion sÏ trung hßa ®iÖn tÝch cña protein. Lµm mÊt líp vë thñy hãa b» ng çch : Thªm çc chÊt háo n íc nh r îu etylic, tanin…

Hai loại biến tính: + ThuËn nghÞch: dd dÞch keo cã thÓ trë l¹i tr¹ng th¸i ban ®Çu sau khi khö t¸c nh©n ®i. Thuéc lo¹i biÕn ®æi nµy gåm cã çc ph/øng: ph/øng diªm tÝch, t¸c dông nhÑ cña cån, axeton ë nhiÖt ®é thÊp. . . + Kh «ng thuËn nghÞch: protein bÞ biÕn ®æi hoµn toµn, bÞ hñy ho¹i, mÊt tÝnh hßa tan trong n íc. Thuéc lo¹i biÕn ®æi nµy gåm: ph/øng g©y sa l¾ng bëi çc muèi kim lo¹i nÆng, ph/øng cña çc alkaloit, acid hoÆc kiÒm m¹nh, ®un s «i. . .

1. Phản ứng diêm tích a. Nguyªn lý Diªm tÝch lµ ph ¬ng ph¸p dïng çc muèi nh : Na. Cl, (NH 4)2 SO 4. . . ®Ó kÕt tña protein. Nguyªn nh©n kÕt tña lµ do çc tiÓu phÇn protein bÞ trung hßa ®iÖn tÝch bởi các ion. Çc protein kh¸c nhau sÏ tña ë những nång ®é muèi kh¸c nhau. Vì vËy cã thÓ t¸ch riªng çc protein ra khái hçn hîp. VD globulin cã KLPT lín h¬n albumin, trong n íc globulin tÝch ®iÖn ( ) Ýt h¬n albumin, globulin bÞ kÕt tña ë nång ®é amoni sulfat b¸n b·o hßa, cßn albumin kÕt tña ë nång ®é b·o hßa.

b. TiÕn hµnh Lấy 2 ống nghiệm: èng 1: lÊy 3 ml LTT, 3 ml dd (NH 4)2 SO 4 b·o hßa, l¾c ®Òu ® îc dd b¸n b·o hßa, globulin bÞ sa l¾ng, ®Ó 5 phót, läc sang è. 2. èng 2: Cho vào ố 2 bét (NH 4)2 SO 4, vừa cho vừa lắc, ®Õn khi b·o hßa, albumin sẽ sa l¾ng. Để 5 phút. Lọc sang è. 3. èng 3: thu được sẽ mang thử bằng ph/øng biure.

c. øng dông KÕt tña b» ng çch nµy çc protein kh «ng bÞ biÕn tÝnh Dïng ph ¬ng ph¸p nµy ®Ó chiÕt suÊt çc protein ho¹t tÝnh.

2. Sa l¾ng b» ng cån a. Nguyªn lý Protein bÞ kÕt tña b «ng hoÆc vÈn trong dung m «i h/c¬ nh : cån, aceton, eter, . . . Do protein bÞ mÊt líp vá thñy hãa Tña cµng dÔ nÕu cã thªm Na. Cl. KÕt tña b» ng cån cã thÓ lµ kÕt tña thuËn nghÞch nÕu tiÕn hµnh ë nhiÖt ®é thÊp (00 ®Õn – 150 C) vµ tña ® îc t¸ch khái cån mét c¸ch nhanh chãng.

b. TiÕn hµnh èng 1 : cho 1 ml cån 96 o èng 2: cho 1 ml cån 96 o, thªm 1 2 giät Na. Cl b·o hßa Cho vµo mçi èng 1 ml dd lßng tr¾ng trøng. èng 3: 1 ml cån 96 o, 1 ml dd gelatin 1%. NhËn xÐt vµ gi/thÝch kÕt quả. c. øng dông Dïng cån s¸t trïng Dïng ®Ó t¸ch chiÕt enzyme

3. Sa l¾ng bëi nhiÖt ®é cao a. Nguyªn lý Protein khi bị ®un nãng sÏ bÞ x¸o trén vÒ mÆt cấu truc ph©n tö, mÊt líp vá thñy hãa nªn mÊt tÝnh hßa tan vµ bÞ ® «ng vãn. HiÖn t îng nµy xảy ra m¹nh ë ®iÓm ®¼ng ®iÖn. NÕu sù biÕn tÝnh nµy xảy ra ë p. H kh¸c nhau (trong m «i tr êng kiÒm m¹nh, hoÆc acid m¹nh), protein vÉn ë tr¹ng th¸i tÝch ®iÖn nªn kh «ng bÞ ® «ng vãn mµ ë d¹ng dung dÞch.

b. TiÕn hµnh LÊy 5 èng, cho vµo mçi èng 2 ml dd lßng tr¾ng trøng. + èng 1: ®un s «i, theo dâi sù kÕt tña. + èng 2: thªm 1 giät a. acid 1% ®Ó t¹o ®iÓm ®¼ng ®iÖn, ®un s «i. + èng 3: thªm 0, 5 ml a. acid 10%, ®un s «i. + èng 4: thªm 0, 5 ml Na. OH 10%, ®un s «i. + èng 5: thªm 0, 5 ml a. acid 10%, 3 4 giät Na. Cl b·o hßa, ®un s «i. NhËn xÐt vµ giải thÝch kÕt quả. c. øng dông Dïng nhiÖt ®é ®Ó hÊp, sÊy tiÖt trïng…c¸c dông cô.

Bài 2: THỰC NGHIỆM VỀ ENZYME 1. Thuû ph©n tinh bét bëi amylase a. Nguyªn lý Tinh bét lµ polysaccharide, gåm nhiÒu đơn vị glucose nối víi nhau bëi lk 1, 4 glycoside vµ 1, 6 glycoside. TB kh «ng cã nhãm aldehyde tù do , nên không cho phản ứng tromer dương tính. Nước bọt có amylase, maltase thủy phân TB cho ra các đường đơn glucose cho phản ứng tromer dương tính.

b. TiÕn hµnh Sóc miÖng b» ng n íc cÊt. NgËm mét Ýt n íc cÊt khoảng 1 3 phót, khÏ cö ®éng l ìi ®Ó trén ®Òu n íc bät víi n íc cÊt, råi cho qua phÔu läc vµo èng được dd chứa amylase. Nhá lªn phiÕn sø 2 d·y dd lugol 1% : 1 TN, 1 ĐC. LÊy 2 èng nghiÖm + èng A: cho 3 ml TB 1%, 2 ml dd amylase (èng TN) + èng B: cho 3 ml TB 1%, 2 ml n íc cÊt (èng ĐC) L¾c ®Òu hai ống, nhá vài giọt từ ống TN vào 1 lỗ ở dãy TN, vài giọt từ ống ĐC vào 1 lỗ ở dãy ĐC. Sau khoảng 2 phút lại nhỏ vào lỗ tiếp theo. Quan s¸t sù ®æi mµu vµ nhËn xÐt. PhÇn cßn l¹i cña 2 èng thö b» ng p. ø. Tromer. Nhận xét kÕt qu¶.

2. Ảnh h ëng cña nhiÖt ®é a. Nguyªn lý PhÇn lín c¸c enzyme cã ho¹t lùc m¹nh ë th©n nhiÖt. NÕu nhiÖt ®é qu¸ thÊp thì enzym sÏ ho¹t ®éng rÊt yÕu, ngù¬c l¹i nÕu nhiÖt ®é cao thì enzyme sÏ bÞ tª liÖt vµ bÞ huû ho¹i. b. TiÕn hµnh LÊy 3 èng nghiÖm + èng 1: cho 1 ml ddamylase, ng©m vµo chËu n íc ®¸ 15’. + èng 2: cho 1 ml dd amylase, ®un s «i , ®Ó nguéi + èng 3: cho 1 ml ddamylase Sau ®ã cho mçi èng 1 ml dd tinh bét 1% l¾c ®Òu, ®Ó yªn trong 5 10’ råi thö b» ng phản øng Tromer hoặc dd lugol 1%. Quan s¸t mµu cña c¸c èng vµ gi¶i thÝch kÕt quả.

3. T¸c dông ®Æc hiÖu a. Nguyªn lý Amylase vµ sucrase lµ 2 enzyme th/ph©n lk glycoside, nh ng amylase chØ th/ph©n lk , 1 4 glycoside cña tinh bét, cßn sucrase chØ th/ph©n lk , 1 2 glycoside cña sucrose. b. TiÕn hµnh LÊy 4 èng nghiÖm + èng 1: cho 1 ml dd tinh bét 1%, 1 ml dd amylase + èng 2: cho 1 ml dd sucrose 1%, 1 ml dd amylase + èng 3: cho 1 ml dd sucrose 1%, 1 ml dd sucrase (men bia) + èng 4: cho 1 ml dd tinh bét 1%, 1 ml dd sucrase L¾c ®Òu råi thö b» ng phản øng Tromer, quan s¸t mµu cña c¸c èng nghiÖm vµ giải thÝch kÕt quả.

4. Ảnh h ëng cña p. H a. Nguyªn lý Vì cã bản chất protein, nªn enzyme rÊt mÉn cảm víi p. H cña mt. Mçi lo¹i enzyme cã mét p. H tèi u trong h®éng, VD pepsin cã ho¹t lùc m¹nh ë p. H 1, 5 2, 5. p. H mt cµng gÇn p. H tèi u, tèc ®é pư cµng cao, nghÜa lµ enzyme hđ cµng m¹nh. Sù thay ®æi p. H dï nhá còng ả/h ®Õn ho¹t ®é cña enzyme, do ả/h ®Õn tr¹ng th¸i ion hãa cña enzyme.

b. C¸ch tiÕn hµnh LÊy thËt chÝnh x¸c vµo c¸c èng nghiÖm ®¸nh sè tõ 1 8 theo chØ dÉn d íi ®©y: Sè èng p. H (ml) 5, 4 1 2 3 4 5 6 7 8 1 5, 8 1 6, 2 1 6, 6 1 6, 8 1 7, 2 1 7, 6 1 8 1 Tinh bét 1% 1 ml 1 ml 1 ml Amylase 0, 5 ml 0, 5 ml L¾c ®Òu, ®Ó 10’ råi thö b» ng ph/øng Tromer, cho biÕt kÕt qu¶ vµ nhËn xÐt.

Phản ứng Tromer Nguyên lý

Đun sôi, quan sát thấy màu sắc biến đổi Chú ý: Không cho nhiều sulffat đồng