Bevezets az UVVisCDspektroszkpia elmletbe s gyakorlati alkalmazsaiba Fejezetek
Bevezetés az UV-Vis-CD-spektroszkópia elméletébe és gyakorlati alkalmazásaiba Fejezetek a fizikai kémiából Ph. D. főtárgy Előadó: Pál Krisztina
CSAK KIRÁLIS vegyületek / komplexek vizsgálatára alkalmas! Centrális királitás Helikális kiralitás
Főbb felhasználási területek (stacionárius mérések) • Enantiomerek egymástól való megkülönböztetése, enantiomertisztaság meghatározás. • Abszolút konfiguráció meghatározás. • Indukált CD: Két v. több CD-jelet nem adó anyagból olyan komplex jön létre, amely CD-jelet ad. • Fehérjék, DNS vizsgálata.
A CD (cirkuláris dikroizmus) jelenség • A síkban polarizált fény két cirkuláris komponense (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) eltérő MÉRTÉKBEN nyelődik el, királis mintán áthaladva. • Abal Ajobb A /c·l ( A=Abal-Ajobb) • bal jobb l=190 -800 nm, e gerjesztés
A síkban polarizált fény két cirkulárisan polarizált komponense
És a cirkuláris dikroizmus jelensége
Enantiomerek CD-spektruma • jobb, (R)= bal, (S), bal, (R)= jobb, (S) bal, (R)- jobb, (R) = jobb, (S)- bal, (S) = (S) bal, (S)- jobb, (S)= jobb, (R)- bal, (R)= (R) TÜKÖRKÉPEK!
Mit mesél a CD-spektrum? • A molekulában lévő kromofór csoportok egymáshoz képesti térbeli elrendeződéséről, vagyis a molekula térszerkezetéről ad információt.
Egy szemléletes modell (Mi történik az elektronokkal? ) • Optikai aktivitás akkor lép fel, ha az elektron a gerjesztés során helikális pályán mozdul el. • Királis molekulában csak az egyik irány lehetséges. Gerjesztéskor VAGY jobbmenetes pályán halad az e-, VAGY balmenetesen. • Ezt a két ellentétes irányban cirkulárisan polározott fény NEM AZONOS MÉRTÉKBEN tudja kiváltani
Egy szemléletes modell (Mi történik az elektronokkal? ) • Akirális molekula esetén nincs helikális töltés elmozdulás. • Vagy nincs is jobb és balmenetes pálya, vagy ugyanolyan arányban veszik igénybe mindkettőt. • MINDEGY, hogy jobbmenetes vagy a balmenetes fény gerjeszt.
Az optikai aktivitás kvantummechanikai értelmezése • Helikális pályán való elmozdulás= lineáris elmozdulás+cirkuláris elmozdulás • Töltés lineáris elmozdulása elektromos momentum ( ) • Töltés cirkuláris elmozdulása mágneses momentum (m) • Rotátorerősség (a CD-sávok intenzitásával arányos): R= ·m= · m cos ( , m)
A hexahelicén enantiomerjeinek CDsáv előjele • =0° • cos =1 • R = (+) =180° cos = -1 R = (-)
Mi kell a CD jelhez (R-hez)? 1. Ott van CD, ahol van abszorpció kromofór csoport ( ) 2. Kell a molekula kiralitása (m) 3. Ennek 3 alapesete: – Önmagában királis kromofór (nagy intenzitás) – Akirális kromofórok királisan rögzítve (COUPLET) – Akirális kromofór királis perturbáló környezettel (kis intenzitás) speciális esete: indukált CD
Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos? ] • Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba. • Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak. • Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a nemkívánt hatásokért felelős
Egy példa (a gyógyszert racémként hozták forgalomba) • A tájékoztató szerint jól használható köhögés, pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén nyugtatószerként. Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a hányingert is csillapítja. • Célcsoport: állapotos nők.
A Contergan hatóanyagának (thalidomide) antipódjai • Kiralitás centrum: A piperidilgyűrűn a H-atom, amely a ftálimid-részhez kapcsolódó C-atomon található.
Az antipódok hatásai • (R)-izomer teratogén hatású (S)-izomer hatékony szedatívum
Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása • Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R): bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés, vérnyomásemelkedés, tremor. • Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító. • Penicillamin: (R): toxikus, (S): krónikus artritis (izületi gyulladás) ellen – fájdalomcsillapító, tünetenyhítő.
Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás • Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság). • A racém részen felüli túlsúly.
Abszorpciós és CD-spektrum CD: a túsúlyban lévő enantiomer koncentrációjával arányos
Enantiomertisztaság meghatározás (koncentráció független) • Anizotrópia-faktor (g-faktor): – A CD spektrum intenzitása/az abszorpciós spektrum intenzitása. – Enantiomerekre egyenlő nagyságú, ellentétes előjelű.
Enantiomertisztaság meghatározás • A g-faktor : – függ az enantiomer összetételtől – független a koncentrációtól nincs bemérési hiba és hígítási hiba.
Enantiomertisztaság meghatározás • g-érték vs. enantiomer összetétel (kalibrációs görbe). • A mintában nem lehet CD-aktív vagy abszorbeáló komponens.
Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei • (1): CD spektrumok összehasonlítása: Kérdéses vegyület hasonló, ismert térszerkezetű vegyület. • (2): Tapasztalati szabály: Adott elektronátmenetekre megadják a CD-sáv előjelét • (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és ennek összevetése a mért spektrummal.
Az ismert abszolút konfigurációjú alapvegyületek
A meghatározandók (1)
Oktáns szabály (ketonokra) (2) • A karbonil-csoport 300 nm körül észlelhető n→π* elektronátmenetéhez indukálódó rotátor erősségéhez a molekula egyes atomjai koordinátáik szorzatával ellentétes előjelű perturbációs hozzájárulást adnak.
Oktáns-szabály alkalmazása a vegyületünkre (2)
Kvantumkémiai számítások (3) • Az egyik enantiomer szerkezetre az e- átmenetek rotátorerőssége (R) számítható. • A számított és a kísérletileg felvett CD spektrumsávok előjelei: – Egyeznek a számítás alapjául szolgáló térszerkezet igazolódott. – Ellentétesek a fenti tükörképe az abszolút konfiguráció.
Indukált CD • Királis gazdamolekula vagy kötőhely (ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely) • Akirális, kromofór vendégmolekula (színezékmolekula, hatóanyagmolekula). • A bekötődő akirális kromofór e-átmeneteit a környezet királisan perturbálja CD-jel indukálódik.
Indukált CD • A cisz-parinársav (akirális, kromofór), a βlaktoglobulinhoz (királis) kötődik. • 1: 1 komplex képződik. • K megállapítható.
Indukált CD • Az emberi vér gyógyszerkötődés szempontjából fontos fehérje-komponense az AGP. • Itt 2 db festékmolekula kötődik az AGP-hez (couplet).
Indukált CD • Ciklodextrinek üregébe gyógyszermolekulát, szinezékanyagot juttatnak (vízoldható lesz, célba juttatható).
Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata • CD spektrum alakja a vizsgált fehérje másodlagos ill. harnadlagos szerkezete. • p. H változás, hődenaturáció, stb. . . → konformációs változás
Másodlagos szerkezet • A távoli UV (180 nm - 260 nm) - amid kromofórok. • amid csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → másodlagos szerkezet.
Harmadlagos szerkezet • A közeli UV (260 nm - 320 nm) - aromás oldalláncok. • azok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → harmadlagos szerkezet.
Másodlagos szerkezetek arányának meghatározása • A kívánt fehérje spektrum kikeveréséhez ezt 4 másodlagos szerkezetet használják leggyakrabban. • Legalább 2, de max. 8 féle különböző komponens
Másodlagos szerkezetek arányának meghatározása • Az ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja • Referencia spektrum: tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintetikus polipeptidek). Ma valós fehérjék.
Másodlagos szerkezetek arányát meghatározó program
A ribonukleáz hődenaturációja • Jobbra: 0. 02% Ribonukleáz A, (0. 001 M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 55, 60, 70, 80 °C-on. • Balra: A CD-jel a hőmérséklet függvényében (222 nm-en).
Köszönöm a megtisztelő figyelmet! Remélem mindenki él még…
- Slides: 42