BAKTERLERDE GENETK MADDE AKTARIMI 1 Bakterilerde Genetik Madde

BAKTERİLERDE GENETİK MADDE AKTARIMI 1

Bakterilerde Genetik Madde Aktarımı n Bakteriler arasında genetik materyalin (DNA segmentinin kısa veya uzun bir kısmı veya tümü) bir vericiden (donör) başka bir alıcıya (resipient) transferi, normal koşullar altında, in vivo veya in vitro olarak kolayca oluşabilmektedir. n Aktarılan genler, eğer bakteriler birbirlerine genetik olarak çok yakınsalar veya DNA sekansları arasında büyük bir homoloji varsa, alıcının kromozomu ile kolayca birleşebilirler. n Eğer, homoloji çok azsa veya ayrı cinslere ait türler ise bu birleşme çok daha az oranda olabilmektedir. n Gen transferleri sonunda, alıcı bakteriler, kendi kromozomuna integre olan yabancı DNA sekansında bulunan genin (veya genler) taşıdığı özel karakterler yönünden pozitif hale dönüşebilirler. 2

Bakterilerde Genetik Madde Aktarımı n n n n Bakteriler arasında oluşan bu doğal gen transferi yanı sıra, biyoteknolojik yöntemlerle de (Rekombinant DNA Reknolojisi) gen aktarımlarını başarı ile gerçekleştirilebilmektedir. Bu teknikte; bir vericide (prokaryotik ve ökaryotik) bulunan ve çok önemli bir proteinin sentezini kodlayan geni (genleri), restriksiyon endonuklease enzimleri ile keserek çıkarmak, bir aracı moleküle (vektör) bağlayarak oluşturulan bu rekombinant vektörü (plasmid, faj, mekik vektörler, virus, bakteri), alıcı bir organizmaya (prokaryotik veya ökaryotik) transfer etmek, ve burada genin ekspresyonunu sağlamak mümkündür (gen klonlaması, moleküler klonlama). Bu teknoloji hastalıkların teşhis, kontrol ve sağaltımın da olduğu kadar araştırmalarda da çok büyük katkılar sağlamaktadır. 3

Bakterilerde Genetik Madde Aktarımı n Bakterilerde doğal gen transferleri başlıca 3 şekilde gerçekleşmektedir: 1) Transformasyon 2) Konjugasyon 3) Transdüksiyon 4

1. TRANSFORMASYON n Bir mikroorganizma, kendisine DNA kompozisyonu yönünden çok yakın olan, diğer bir mikroorganizmaya ait genetik materyal (DNA segmentleri) içeren bir ortamda üretilirse, n belli bir süre sonra, bu sıvı ortamdan katı besi yerine ekimler yapılırsa, n bazı kolonilerin değişik morfolojide olduğu ve bunların, genetik materyali veren ölü mikroorganizmanın orijinal kolonilerine benzediği görülür (Transformasyon). 5

1. TRANSFORMASYON n Örn; D. pneumoniae 'nin II-R suşu, n kendisini oluşturan II-S suşundan ekstre edilen DNA materyalini ihtiva eden uygun bir sıvı ortamda ve uygun bir süre temasa bırakıldıktan sonra, n katı besi yerine yapılan ekimlerde bazı kolonilerin II-S karakterinde olduğu görülür. n Bu denemede, II-S suşu öldürülmüş ve elde edilen DNA ekstraktları ortama katılmıştır. n Canlı olan II-R suşu ortamda bulunan II-S suşuna ait bazı genetik materyalleri almış ve bu elementlerde taşınan karakterler yönünden pozitif hale gelmiştir (II-S haline dönüşmüştür). 6

1. Transformasyon 7

1. Transformasyon 8

1. Transformasyon n Bildirilen in vitro transformasyon, aynı şekilde, in vivo olarak ta oluşturulabilir. n İn vivo transformasyon, Griffith'in deneyi ile gösterilebilir. n Farelere, önce virulent ve kapsüllü olan II-S suşundan mutasyonla elde edilen canlı II-R suşu (avirulent ve kapsülsüz) verilir. n Bunun arkasından, ısı ile öldürülmüş olan II-S suşundan fazla miktarda enjekte edilir (aslında II-R suşu pneumonia oluşturmadığı gibi, II-S 'de öldürülmüş olduğu için infeksiyöz yeteneği yoktur). n Ancak, deneme sonunda ölen farelerden katı besi yerine yapılan ekimlerde, üreyen koloniler arasında, bazılarının II-S karakterinde (kapsüllü ve virulent) oldukları görülür. n Bu durum, aynı in vitro deneyde olduğu gibi, II-R suşları, fare vücudunda, II-S 'lere ait bazı genetik materyalleri almış ve II-S karakterine dönüşmüş ve fareleri öldürmüştür. 9

Bakterilerde Genetik Madde Aktarımı 1. Transformasyon n Bu iki (in vivo ve in vitro) denemede, ortak olan nokta; n verici hücre (bakteri) DNA parçacıklarının, alıcı hücre (bakteri) kromozomu ile birleşmiş olması ve verici hücreye ait karakterleri yönünden alıcıda pozitifliğin elde edilmesidir. n Her iki hücrenin de antijenik yakınlığının çok fazla olması (birbirinden mutasyon ile türemiş olmaları) gen alışını kolaylaştırmaktadır. n Antijenik yakınlığı olmayan bakteriler arasında transformasyon, genellikle, nadirdir. 10

2. KONJUGASYON n Konjugasyon, verici hücre DNA'sının tümünün veya bir segmentinin, ya bu iki hücrenin direkt teması veya seks pilusları aracılığı ile alıcıya aktarılması olayına verilen bir isimdir. n Konjugasyonda, verici durumda olma kabiliyetini, genellikle, hücrede bulunan ve nakledilebilir bir genetik element olan plasmidler tayin ederler. Bu plasmide fertilite faktörü (F-faktörü veya seks faktörü) adı verilir. n Bu faktörü alan hücreler taşınan karakterler yönünden pozitif hale gelirler. Aktarma olayı 10 -5 -10 -6 oranında meydana gelmektedir. 11

2. Konjugasyon n n İki hücre arasında konjugasyonun gerçekleşebilmesi için, bunların birbirleriyle temasa gelmesi gerekir. Bu olguyu, direkt temas kadar, genellikle, verici hücrelerdeki seks pilusları da yaparlar. Seks piluslarının sentezlenmesini hücre içinde bulunan seks faktöründeki özel genler sağlarlar. Bunlar, diğer normal piluslardan (fimbria) daha uzun ve kalındırlar. Ortaları boş olduğundan bir boru ve geçit köprüsü görevini yaparlar. Genetik materyal buradan geçerek alıcıya aktarılır. Normal pilusların gen aktarmasında rolleri yoktur. Konjugasyonla aktarılabilen birçok ekstra kromozomal genetik element bulunmaktadır. Bunlar arasında başlıca; üvirulens faktörleri, fertilite faktörü (F-faktörü), dirençlilik faktörleri (R-faktörleri) ve kolisin faktörü (Col-faktörü) en önemlileri arasındadır. 12

2. Konjugasyon n n Laboratuvarlarda, konjugasyon oluşturmak için, F+ hücrelerle F- hücreler uygun bir inkübasyon ısısında belli bir süre aynı yerde bir arada bulundurulurlar. Her şeyin normal gittiği durumlarda transfer, m. o. nın türüne göre değişmek üzere, 90 -140 dakikada gerçekleşir. Bir dakika içinde yaklaşık kromozomun %1'lik segmenti geçebilir (ki bu da tüm kromozomun 11 nm'lik bir parçasını (veya iplikçik başına 5 x 106 nukleotid) oluşturur). Konjugasyon transferinden yararlanılarak bakteri kromozomunun gen haritası çıkarılmaktadır. Örn, Hfr x F- hücreler birbirleriyle temasa getirildikten sonra belli aralıklarla (her dakika veya iki dakikada bir) karışım çalkalanılarak gen transferine mani olunur veya kromozom koparılır. 13

2. Konjugasyon n F faktörü ihtiva eden hücrelerde bu faktörün kromozom üzerinde olması çok önemlidir. Ancak, böyle hücreler (Hfr, high frequency recombination) yüksek sıklıkta genetik materyallerini aktarabilirler. n Kendisinde F faktörü olan, ancak bunu kromozomu üzerinde taşımayan hücrelerde (F+) aktarma oranı daha düşüktür. n Bazı durumlarda da F faktörü konakçı hücreden ayrılabilir ve böylece hücre F- hale gelir (Hfr F+ F-). Diğer bir ifade ile hücreler, plasmidden kurtulabilirler (iyileşme). n Bazı durumlarda da akridin boyaları, hücre içinde bağımsız olarak bulunan F faktörünün replikasyonuna engel olmak suretiyle hücreleri F faktörünün etkisinden kurtarabilir. n Bazı olaylarda da Hfr hücrelerinden F faktörü ayrılırken, F faktöründen bir kısmı alıcı hücre DNA'sında da kalabilir. 14

2. Konjugasyon n F faktörü bir hücrede başlıca 3 pozisyonda bulunabilmektedir: n 1 - Bağımsız genetik element (F+), (Plasmid) 2 - Konakçı DNA'sı ile birleşmiş olarak (Hfr) (episom) 3 - Bağımsız fakat, konakçı DNA'sından bir parça olarak (F' prime). n Bu durumları ile F faktörü, E. coli ‘nin lambda (l) fajına benzemektedir. n Bu faj, serbest veya virulent faj halinde bulunabileceği (plasmid) gibi, konakçı DNA'sı ile birleşmiş (profaj) (episom) veya konakçıdan laktoz genini almış olarak ta bulunabilir (F'prime). 15

3. TRANSDÜKSİYON n Genetik materyalin verici bir bakteriden alıcı bir bakteriye fajlar aracılığıyla nakledilmesine transdüksiyon adı verilir. n Transdüksiyon ile gen aktarılma olayına; n Gram negatif (Salmonella, E. coli, Shigella, Proteus, Vibrio, P. aeruginosa, vs. ) ve n Gram pozitif mikroorganizmalarda (Stafilokok ve basiller) rastlanılmıştır. n Fajlar, bakterileri parçalayan veya lize eden viruslardır (bakteriyofaj). Konakçıya özel olduklarından, bakteri fajları arasında da tür spesifitesi vardır. 16

3. Transdüksiyon n n Bazı fajların genomu, konakçı hücresine girdikten sonra orada replike olur ve bakteriyi parçalar (virulent, vegetatif fajlar). Bir kısmı ise, infekte ettiği hücreyi lize etmeyebilir (temperate fajlar). Böyle fajlardan bazıları sitoplazmada kalır veya bazıları da konakçı DNA'sı ile birleşebilir. Böylece onun bir devamı haline gelebilir (profaj). İçerisinde profaj halinde bakteriyofaj bulunduran lizojenik hücreler, ultraviolet ışınlarına maruz bırakılırsa, profaj aktive olur ve konakçısını lize edebilir. Profajlar, yerleştikleri konakçı DNA'sından bir veya birkaç gen içeren bir segment parçasını alabilir ve bunu, adsorbe olduğu başka alıcı hücreye aktarabilir. 17

3. Transdüksiyon n Transdüksiyon başlıca üç tarzda gerçekleştirilebilmektedir. 1 - Generalize transdüksiyon, 2 - Özel transdüksiyon, 3 - Abortif transdüksiyon. 18

Bakterilerde Genetik Madde Aktarımı 3. Transdüksiyon 19

Transdüksiyon: 1. Generalize Transdüksiyon n Generalize transdüksiyonda, bakteri hücresi içinde faj olgunlaşırken, parçalanan konakçı DNA'sından bir segment, aynı yerde sentezlenen faj kapsidi içine tesadüfen girebilir. n Böylece bu kapsid, faj DNA'sından ayrı olarak ve değişik uzunlukta (50 -100 gen) bakteri DNA'sını da ihtiva etmiş olur. n Böyle bir faj etrafa yayıldıktan sonra, başka bir bakteriyi infekte ettiğinde, kendi DNA'sı ile birlikte konakçı DNA'sını da alıcı hücreye aktarır. n Eğer, faj, taşıdığı bu bakteri DNA'sı ile birlikte konakçı hücrenin kromozomu ile birleşirse, taşıdığı karakterler yönünden alıcı hücreyi pozitif hale getirir. n Birkaç krossover dan sonra bakteri DNA'sı ile birleşebilen bu faj+bakteri DNA segmenti, alıcı hücre kromozomunun bir devamı haline gelir, birlikte replike ve transkripte olur ve taşıdığı genlerdeki bilgiler aynen m. RNA'ya aktarılarak translasyona iştirak eder. 20

Transdüksiyon: 2. Özel Transdüksiyon n Özel transdüksiyon oluşturan fajlar, konakçı DNA'sında belli bazı genlerin yanına yerleşirler ve hücre DNA'sı ile birleşerek profaj haline dönüşürler. n Konakçı hücrenin kromozomu ile birleşmiş bulunan faj, konakçı hücre UV-ışınlarına maruz bırakılırsa, aktive olur ve DNA'dan veya yerleştiği yerden ayrılarak konakçısını lize ederler. n DNA'dan ayrılırken, yanında bulunduğu veya yanına yapıştığı bakteriye ait geni de birlikte alarak ayrılırlar. n Böyle bir faj başka bir bakteri kültürüne inokule edilirse buradaki hücreleri infekte ettiğinde bu taşıdığı geni, o bakteriye aktarır ve bakteriyi, gende bulunan özel karakterler yönünden, pozitif hale getirir. 21

Transdüksiyon: 2. Özel Transdüksiyon n Bazı durumlarda, profaj, konakçı hücresinden ayrılırken ve konakçı DNA'sından bir segment alırken buna karşılık kendi DNA'sından da bir kısmını, konakçı DNA'sı üzerinde bırakabilir. n Böylece DNA'sında eksik genler bulunan faj, bu durumuyla başka bir bakteriyi infekte ettiğinde, n bu alıcı hücre içinde eksik genlerin oluşturacağı veya sentezlediği önemli ürünleri bulamazsa n ve bu bakteri de, eğer bu ürünleri sentezleyecek bilgilere haiz başka bir fajla infekte olmazsa, n eksik olan faj genomu replike olamaz ve olgunlaşamaz. Böyle transdüksiyona da Sınırlı Transdüksiyon adı verilir. 22

Transdüksiyon: 3. Abortif Transdüksiyon n Fajlar tarafından, konakçısından alınan ve bazı karakterleri (genleri) taşıyan DNA segmenti, faj başka hücreyi infekte ettiğinde, bu hücreye aktarılır. n Ancak, bu DNA parçası hücre içinde kalır, bakteri DNA'sı ile birleşmez. n Bağımsız olarak hücre içinde bulunmasına karşın, hücre DNA'sı ile eş zamanda replike olma kabiliyetine de sahip değildir. n Ancak, taşıdığı karakterler yönünden hücreyi pozitif hale getirebilir. 23

Transdüksiyon: 3. Abortif Transdüksiyon n n n Bakterinin her bölünmesinde, bu ekzogenot bir kardeş hücrede kalır ve onu pozitif hale sokar. Böylece DNA segmenti replike olmadan, bakterinin her bölünmesinde bir hücre kalmış olur. İlk başlangıçta, bu ekzogenotu taşıyan, fakat sonra, hücre bölünmesi sonu, diğer hücrede kalması nedeniyle sonradan bunu kaybeden bir bakterideki enzimler, müteakip bölünmeler de giderek azalır ve kaybolur. O zaman hücreler, bu enzimleri ihtiva etmediğinden negatif hale dönüşürler. 24

Bakterilerde Genetik Madde Aktarımı Transdüksiyon: 3. Abortif Transdüksiyon 25

GENETİK REKOMBİNASYONLAR n Verici bir bakteriden, çeşitli tarzlarda aktarılan genetik materyallerin (ekzogenot) beklenilen etkinlikte olabilmesi için, sitoplazma içinde bulunmasından ziyade, alıcının kromozomu ile birleşmesi (integre olması) gereklidir (Rekombinasyon). n Bazı durumlarda alıcının sitoplazmasına giren yabancı DNA sekansları, burada kalabilir ve kromozomla birleşmeyebilir. Böyle durumlar, daha çok alıcı ile verici hücre DNA kompozisyonlarının farklı olduğu hallerde meydana gelebilir. n Böyle olgular, sekanslar arasında homolog bölgelerin veya özel birleşme yerlerinin çok az veya olmamasından kaynaklanır. 26

GENETİK REKOMBİNASYONLAR n n Rekombinasyonda; Alıcının DNA'sına integre olan verici DNA sekansları, kromozomun bir devamı veya bir parçası haline gelerek, onunla birlikte ve eş zamanlı (senkronize) olarak replike olur ve ekspere edilir. Replike olan DNA segmenti, kardeş hücrelere de taksim edilir. Eğer aktarılan yabancı DNA sekansında, alıcıda bulunmayan özel genler varsa, bunlar da aynen aktarılır ve alıcı hücre bu genlerin taşıdığı özel karakterler yönünden pozitif hale gelebilirler. Ancak, bazı durumlarda da, yabancı DNA sekansları, alıcının baz sıralarını değiştirerek veya genleri bölerek mutasyonlara yol açabilir. Sitoplazmaya ulaşıp da alıcının kromozomu ile birleşmeyen sekanslar, alıcının endonukleaseları tarafından kolayca parçalanabilir ve etkinliği böylece giderilmiş olur. 27

GENETİK REKOMBİNASYONLAR n Yabancı DNA sekanslarının alıcının kromozomu ile integre olabilmesi başlıca 3 mekanizma ile gerçekleşmektedir: 1) Homolog (genel) rekombinasyon 2) Site specific recombination (özel rekombinasyon) 3) Nonhomolog rekombinasyon 28

HOMOLOG REKOMBİNASYONLAR n n n Bu rekombinasyonda, alıcının hücre duvarından ve belirli yerlerinden içeri giren lineer formdaki DNA segmentleri hemen sirküler forma dönüştürülür. Böyle bir molekülde bulunan ve alıcının kromozomu ile komplementer (homolog) olan bölgeler karşıya gelirler. Homolog bölgelerde meydana gelen karşılıklı kopmalar sonunda, vericinin sekansları alıcının DNA sekansları arasında krosoverla (crossover) integre olur. M. o. lar arasında başlıca genel rekombinasyon türleri; 1) Bakteri X bakteri rekombinasyonu 2) Faj X faj rekombinasyonu 3) Plasmid X plasmid rekombinasyonu 4) Bakteri X plasmid rekombinasyonları 5) Virus X virus rekombinasyonu 29

SİTE SPESFİK (ÖZEL) REKOMBİNASYONLAR n n n Bakterilerin kromozomları üzerinde, bazı yabancı genler için özel alıcı bölgeler bulunmaktadır. E. coli K-12’ye ait Lambda (+) fajı. Bu faj iojenik formda, bakteri kromozomunda biotin ile galaktoz genleri arsında bulunan 15 bp’lik özel bölgeye integre olur. 30

NONHOMOLOG REKOMBİNASYONLAR n n DNA segmentleri arasında genetik homolojiye dayanmayan birleşmeler nonhomolog rekombinasyonlar olarak tanımlanmaktadır. Bakterilerinde rastlanan transpozonlar (Tn) ve İnsersiyon sekansları (İS-elementleri) nın bakteri veya plazmid üzerinde veya karşılıklı yer değiştirmeleri örnek olarak verilebilir. 31

n n n Prionlar ve Replikasyonları İnsanlarda ve hayvanlarda (Scrapie, BSE, TME, FSE, vd) Transmissible Spongiform Ensefalopati (TSE)'lere Prion proteini (Pr. P) olarak tanımlanan ajanların neden olduğu açıklanmıştır. Bu etkenlerin 20 nm'den küçük ve 254 amino asitlik sekanslara sahip oldukları belirtilmiştir. Ajan; DNA veya RNA gibi, bakteri veya viruslarda bulunan genetik materyallerin hiç birine sahip olmaması, yüksek ısıya dayanması, DNase ve RNase'lardan etkilenmemesi nedeniyle virus veya bakteri olarak kabul edilmemektedir. 32

n n n Prionlar ve Replikasyonları Etkenin; proteinaz K, iyonizan ışınlara, UV-ışınlarına, yüksek ısıya (134 -138°C ve 60 dk), nukleazlara (DNase, RNase) ve bazı dezenfektanlara (formol, Beta-propiolakton) dirençli, buna karşın proteolitik enzimlere duyarlı olduğu açıklanmıştır. Elektron mikroskopla yapılan çalışmalarda, BSE'li hayvanların beyninde, aynen Scrapie'li koyunlarınkinde rastlanan SAF'ların (Scrapie associated fibrin) eş değeri olan amiloid fibril (amiloid plaklar, amiloid proteinler, amiloid flament) kümeleri oluşur. Bu fibrillerin hastalık oluşturma yetenekleri vardır ve bunlar prion proteinlerinin de esasını oluştururlar. 33