AZOSPERMK NFERTL ERKEKTE GENETK TESTLERDE YENLKLER Yrd Do

AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE YENİLİKLER Yrd. Doç. Dr. Hakan Özveri Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı

Genetikte Yaşanan Gelişmeler • “ERA of GENOMICS” • “GENETİK ÇAĞI” • Tüm DNA sekanslarının sistematik olarak çalışılarak ortaya konulması • Human Genome Project(HGP)İnsan Genom Projesi • International Hapmap Project • Encylopedia of DNA Elements Project(ENCODE)

Genetikte Yaşanan Gelişmeler • 30 -35 bin gen (Tahmin 80 -140 bindi) • Normal spermatogenezde görev alan gen sayısı: 2000 ve üzeri • 1 no’lu kromozom- 2968 gen • Y Kromozumu 231 gen • Gen az ama ürün çeşitliliği inanılmaz!!!(500 bin-1 milyon protein)

Microarray Teknolojisi • • Gen çipi DNA çipi Biyoçip Ekprese edilen binlerce genin ekspresyon düzeyini aynı anda izlemek için sıralı bir şekilde oluşturulmuş DNA spotları

Microarray Teknolojisi • Microarray’de onbinlerce spot • Yüzeye tutturulan DNA segmentleri (20 ile 100 ya da daha fazla nükleotid uzunluğunda olabilir) probe olarak tanımlı

Microarray Teknolojisi • Tüm sekanslama girişimlerinde olduğu gibi microarray kullanımında da amaç • Bir organizmanın belirli bir hücresinde, belirli bir zamanda ve belirli koşullar altında hangi genler ifade edilmektedir?

Microarray Teknolojisi Anormal Hücreler RNA İzolasyonu Reverse Transcriptase İşaretleme Microarrayde Hibridizasyon Normal Hücreler

Microarray Teknolojisi-İnfertilite • Spermiyogramda anomali saptanmayan fertil ve infertil erkeklerde Microarray analizlerinin karşılaştırılması • Fertil ve infertil erkeklerin Transkriptom’ları arasında istatistiki fark var. Özellikle erkek gamet formasyonu ve maturasyonu ile ilgili genlerin ekspresyonlarında anlamlı farklar mevcut. Garrido N ve ark. , Fertil Steril; Vol 91, No: 4, Supp Nisan 2009

Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji Tanı (n=500) % Varikosel Obstrüksiyon Testiküler Yetmezlik Idiyopatik Ejakülatuar Kriptorşidi ASA Genetik nedenler Gonadotoxinler Infeksiyonlar Sistemik hastalıklar Endokrinopati Travma 34. 0 26. 0 16. 4 26. 0 2. 4 3. 0 2. 0 0. 5 2. 0 1. 0 0. 2 1. 0 Çoğunluğunda tam gösterilememiş olsa da GENETİK PATOLOJİ? HGP Öncesi

Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji 1. Genetik (%15 -20) A)Kromozomal Bozukluklar Klinefelter Sendromu (XXY) Diğer Eşey kromozomal değişik. Robertsonian Translokasyonlar Resiprokal Translokasyonlar B)Y Kromozom Delesyonları AZFa AZFb AZFc AZFb-c AZFa-b AZFa+b+c Parsiyel AZFc AZF dışında C)Gen Mutasyonları CFTR (CBAVD hastalarında %60 -70) Obstrüktif Azoospermi AR INSL 3 -LGR 8 2. Varikosel (%35) 3. İdiyopatik (%25) 4. Enfeksiyon (%10) 5. Endokrin (<%5) 6. İmmünolojik (<%5) 7. Kanal Obstrüksiyonları(<%5) Azoospermi- Normospermi Azoospermi-Şiddetli Oligospermi Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi Azoospermi-SCOS %0. 4 Azoospermi-Spermatogenik Arrest Azoospermi-Şiddetli Oligospermi SCOS/Spermatogenik Arrest %0. 7 Azoospermi-SCOS-Şid. Oligospermi %0. 1 Azoospermi-SCOS %0. 3 Azoospermi-Normospermi ~%5. 8 ~%4. 15 %0. 75 ~%8. 2 %1. 3 %2. 7 %2. 3 %0. 5 %1 -6 Azoospermi-Oligospermi Kriptorşidizm %5 %1. 7 <%5

İNFERTİLİTEDE GENETİK 9. 766 İnfertil Erkek 94. 465 Erkek Yenidoğan Kromozomal Anomali %5. 8 %0. 38 Seks Kromozomal Anomali %4. 2 %0. 14 Otozomal Kromozomal Anomali %1. 5 %0. 25 Johnson MD, Fertil Steril, 1998; 70: 397 Van Assche E, Hum Reprod, 1996; Dec; 11 Suppl 4: 1 -24.

İnfertilite - Azoospermi: % 5 -20 %

Azoospermi değerlendirmesinde Amaç – Ürolog gözüyle Düzeltilebilir patolojilerin saptanması ve tedavisi İnfertilite ile görülebilen hayatı tehdit edici hastalıkların tanınması ve tedavisi Üremeye yardımcı tedavi yöntemlerine gereksinimi azaltmakmaliyetin düşürülmesi Üremeye yardımcı tedavi yöntemleri ile çocuklara geçebilecek genetik geçişli patolojilerin saptanması ve çiftlerin bilgilendirilmesi

Azoospermi Değerlendirmesi 10 Anamnez Fizik muayene Semen analizi (2 x) Hormonal değerlendirme Genetik değerlendirme Radyolojik değerlendirme 20 Biyopsi/Sitoloji Azoospermi En az 2 semen analizinde, mikroskopik incelemede ejakülatta hiç spermatozoa görülmemesi durumu TEDAVİ

GENETİK BOZUKLUKLAR • Grup I: Kromozoma ait nümerik ya da yapısal anomaliler 47 XXY Kromozomların yapısal anomalileri (delesyon, duplikasyon, inversiyon, translokasyon) • Grup II: Epigenetik Mutasyon ya da kırılma olmaksızın oluşan ve gen ekspresyonunu değiştiren biyokimyasal DNA modifikasyonları (DNA Metilasyonu, Histon asetilasyonu, histon fosforilazyonu, kromatin re-modelling) • Grup III: Tek gen hastalıkları Kistik Fibrozis • Grup IV: Poligenik/multifaktöryel genetik hastalıklar En sık görülen ve insanda infertilitede dahil hastalıkların çoğunluğunda etyolojik faktör • Grup V: Non-Kromozomal DNA Mutasyonları Mitokondriyal Mutasyonlar

Kromozomal Anomaliler(Nümerik) Klinefelter Sendromu (47 XXY – Non-mozaik Form) • 1/500 -1/1000 canlı doğumda • Azospermide en sık kromozomal neden(%14) • Atrofik testisler ( ~ 5 ml) Klasik Triad ? • Azospermi • Jinekomasti • KS’lu hastaların %80 -100’ünde normal haploid sex kromozomu • Sperm elde etme oranları %27 -45 Denschlag ve ark. , Fertil Steril, 2004

Klinefelter Sendromu Tanı 1. Periferik kandan karyotip analizi Uzun süre, fazla işgücü, pahalı, Mozaik tipte düşük sensitivite 2. Yanak içi mukozasından Barr Body(Cisimcik) Sitolojisi Ucuz ve sensitif 3. FISH Pahalı, tecrübeli eleman, software 4. X Kromozomu üzerindeki iki genin metilasyon düzeyleri arasındaki fark – 5 $ Familial Mental Retardation Gene 1 (FMR 1) ile X-Chromosome Inactivating Transcript(XCIT) 5. Quantitative Flourescence PCRMultipl genetik patoloji

Kantitatif Floresan PCR(QF-PCR) • Seks kromozom anomalileri • Mikrodelesyonlar/Duplikasyonlar • AR CAG tekrarları • Bütün kromozomal bozuklukların eş zamanlı saptanabilmesi

Y Kromozom Mikrodelesyonları • Erkek infertilitesi ile Y Kr. Mikrodelesyon ilişkisi : 1976 Tiepolo ve Zuffardi Y Uzun kolunda AZF bölgesi Gen bölgesi Aday Gen/genler AZFa USP 9 Y, DBY(Dead Box on the Y), UTY AZFb E 1 F 1 AY, RBMY AZFc DAZ, CDY 1, BPY 2, PRY AZFd DYS 237 • Oligospermi - %6 -8 • Azospermi - %3 -15

AZF delesyon tiplerinin dağılımı

Y-Mikrodelesyonlarında Sperm Elde Etme Sperm Komplet AZFa ya da AZFb Kombine AZFa+AZFb+AZFc Kombine AZFa+AZFc Parsiyel AZFa ve AZFb(Tek ya da kombine) Parsiyel ya da komplet AZFc Kombine parsiyel AZFb+AZFc + + +

Y-Mikrodelesyonlarında Testis Histolojisi Histoloji Komplet AZFa Germ Hücre Aplazisi ya da SCO Komplet AZFb Matürasyon arresti(Spermatosit ya da spermatid evresinde) Komplet AZFc Şiddetli Hipospermatogenez Şiddetli Oligospermi Kombine parsiyel AZFa+AZFb Miks Histoloji Kombine parsiyel AZFb+AZFc SCO ya da matürasyon arresti

Gr/gr Delesyonları • AZFc bölgesinde segmentler arasındaki Homolog Rekombinasyonlar sonucu • 21 gen delesyona uğrar • AZFc’de DAZ geninden 2 kopya, CDY 1 den 1 kopya ve çeşitli transkripsiyon ünitelerinden de bazı kısımların delesyonu

AZFc • AZFc delesyonu olan erkeklerde zamana bağlı olarak sperm üretiminde azalma Simoni ve ark, Fertil Steril, 1997, 67: 542 -547 • AZFc delesyonu bilinen erkeklerde Kriyoprezervasyon yapılmalıdır. Krausz C ve ark, Hum Reprod, 1999, 14: 1717 -1721

AZF Duplikasyonları • 4 adet DAZ geni oluşumu ile giden duplikasyonlar Repping 2003, 2004 • AZFc parsiyel duplikasyonu erkek infertilitesinde bir risk faktörüdür. Lin ve ark. , 2007, Hum Mutat • Azospermik ve Oligospermik hastalarda DAZ gen sayısında artış Writz ve ark. , 2005, Fertil Steril

Y Kromozom Mikrodelesyonları Klinik Önemi • Spermatogenezde ciddi bozulma • İnfertiliteye neden olan genetik hastalıklar arasında en sık tespit edilen bozukluk • Yardımla üreme teknikleri Üreme için tek şans • Sperm elde etmenin mümkün olmadığı durumlar(AZFa, AZFb) • Erkek çocukta da kalıtsal olarak Mikrodelesyon geçişi • Genetik bilgilendirme çok önemli!

EPİGENETİK Epigenetik Modifikasyon Transkripsiyondaki Rolü DNA Metilasyonu Gen Baskılanması Histon Metilasyonu Gen baskılanması ve aktivasyonu Histon Demetilasyonu Gen baskılanması ve aktivasyonu Histon Asetilasyonu Gen aktivasyonu Histon Deasetilasyonu Gen baskılanması Histon Fosforilizasyonu Gen aktivasyonu ve baskılanması Histon Ubiquitylation Gen baskılanması ve aktivasyonu Histone sumoylation Gen baskılanması

Gen Mutasyonları Kistik fibroz gen mutasyonları Konjenital bilateral vaz deferens agenezisi İdiyopatik bilateral epididimal obstrüksiyon Kallman sendromu (KAL-1) Androjen reseptör gen mutasyonu İmmotil silia sendromu Polikistik böbrek hastalığı Orak hücre anemisi ve talasemi

Kistik Fibrozis-CBAVD • • Otozomal resesif geçiş 1/2500 sıklık Pulmoner ve pankreatik fonksiyon bozukluğu 7 q 31 üzerinde ”Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Geni” • CVAD’li hastaların %85’inde en az 1 CF gen mutasyonu • KF’li hastaların >%95 CBAVD nedeni ile infertil

Kistik Fibrozis-CBAVD • Klinik – Kronik pulmoner obstrüksiyon ve enfeksiyonlar – Pankreatik yetmezlik – Neonatal mekonyum ileusu – İnfertilite

Kistik Fibrozis-CBAVD • Muayene – Epididim gövde ve kuyruğu yok – Testis, caput epididim palpabl

Kistik Fibrozis Kromozom 7 q. 31. 2 >1200 mutasyon En sık görülen 24 mutasyon Mutasyon Sıklık% ΔF 508 66 R 117 H 0 0. 3 A 455 E 0. 1 G 542 X 2. 4 R 1162 X 0. 3 S 549 N 0. 1 G 551 D 1. 6 R 347 0. 2 R 560 T 0. 1 N 1303 K 1. 3 Dl 507 0. 2 1898+1 G®T 0. 1 W 1282 X 1. 2 3849+10 kb. C®T 0. 2 2184 del. A 0. 1 R 533 X 0. 7 G 85 E 0. 2 2789+5 G®A 0. 1 621+1 G®T 0. 7 1078 del. T 0. 1 3659 del. C 0. 1 1717 - G®T 0. 6 R 334 W 0. 1 711+1 G®T 0. 1 Jarvi K, Chan PTK. In: “Reproductive Medicine Secrets”. 2004. Chan PTK. J Male Sex Reprod Health. 2002; 2: 161 -164.

Kistik Fibrozis-CFTR • CFTR geni non-coding DNA bölgesinde İntron 8’in splicing alanında Polythymidine yolunda varyasyonlar, azalmalar (5 T, 7 T, 9 T) • 5 T azalması Splicingde azalma CFTR m. RNA’da %50 azalma Matür ve fonksiyonel CFTR proteininde azalma

CFTR-Fertilite • Sperm kapasitasyonu için hücre içi p. H ve Plazma membran hiperpolarizasyonu • Gerekli olan- Ekstraselüler HCO 3 • Adenil siklaz aktivasyonu ve CAMP üretimi • Sonuç- CFTR spermde azalmış fertilizasyon kapasitesine neden oluyor. Xu MW ve ark, Proc Natl Acad Sci, June 2007

Kistik Fibrozis-CFTR • İdiyopatik Obstrüktif Azospermide ve Palpable Vaz Deferens %50 CFTR gen Mutasyonları • Öneri : CBAVD, CUAVD ve İdiyopatik Obstrüktif Azospermide CFTR taraması (5 T)

Kistik Fibrozis-CBAVD Klinik Önemi • 1 partnerde CFTR mutasyonu var ise diğer partneri tara! • Erkekte CBAVD var ise kadın partneri tara! • CBAVD, CUAVD de renal hipoplazi ya da ageneziyi araştır!

Androjen Reseptör Gen Mutasyonları • 1/60. 000 sıklıkta • AR’nin olmaması ya da fonksiyonel olarak farklılaşması • X Kromozomu üzerinde (Xq 11 -q 12) • 300’den fazla mutasyon

Androjen Reseptör Gen Mutasyonları • • • AR – 8 exon Exon 1 – CAG Tekrarı Normal bireylerde 17 -26 tekrar Hasta bireylerde 40 -52 tekrar Tanı – PCR ile AR CAG tekrar bölgesinin incelenmesi

Erkek faktörüne Bağlı İnfertilitede GENETİK Hangi hastada hangi test? Non-obstrüktif azoospermi Karyotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi Şiddetli oligospermi Karyotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi CBAVD – obstrüktif azoospermi Kistik Fibrozis taraması– Genişletilmiş panel 5 T analizi (Tek ya da çift taraflı vaz deferens yokluğu tespit edildiğinde)

İnfertilitede genetiğin rolü • Yanıt bekleyen sorular: • 1 -Normal spermatogenezde, sperm maturasyonunda ve sperm • • fonksiyonlarında hangi genler rol oynamaktadır? 2 - İnfertiliteye yol açan polimorfizm ya da mutasyonlar nelerdir, bunları saptayarak hastaları daha iyi tedavi edebilir miyiz? 3 - Spermatogenez esnasında normal gen ekspresyonunu düzenleyen mekanizmalar nelerdir? 4 - Erkek infertilitesinde anormal mayotik rekombinasyon ya da ayrışma nasıl rol oynar? 5 - Embriyogenez üzerinde anormal DNA hasarlarının etkisi nedir?

SONUÇ • Daha ayrıntılı genetik ve moleküler çalışmalara ihtiyaç var • Yeni metodlar hızlı, tekrarlanabilir ve maliyeti kabul edilebilir olmalı