AZIENDA OSPEDALIEROUNIVERSITARIA POLICLINICO GASPARE RODOLICO CATANIA UNIVERSITA DEGLI

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AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA POLICLINICO “GASPARE RODOLICO” CATANIA UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI CATANIA CARCINOMA DEL COLLO

AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA POLICLINICO “GASPARE RODOLICO” CATANIA UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI CATANIA CARCINOMA DEL COLLO DELL’UTERO E VACCINAZIONE ANTI HPV ASPETTI VIROLOGICI Guido Scalia Dip. di Sc. Microbiologiche e Sc. Ginecologiche Laboratorio Centralizzato di Analisi Policlinico di Catania U. O. Virologia Clinica guidoscalia@alice. it e-mails lido@unict. it

I VIRUS MOLTI VIRUS SONO PRESENTI, ANCHE IN FORMA ASINTOMATICA, A LIVELLO GENITALE ED

I VIRUS MOLTI VIRUS SONO PRESENTI, ANCHE IN FORMA ASINTOMATICA, A LIVELLO GENITALE ED URINARIO PIU’ RILEVANTI PER SINTOMATOLOGIA E/O PROGNOSI: HSV E PAPILLOMAVIRUS

CLASSIFICAZIONE Un tempo classificati come Papovaviridae successivamente in famiglie Polyomaviridae Papillomaviridae genere Polyomavirus Papillomavirus

CLASSIFICAZIONE Un tempo classificati come Papovaviridae successivamente in famiglie Polyomaviridae Papillomaviridae genere Polyomavirus Papillomavirus (virus SV 40, JC, BK)

PAPILLOMAVIRUS (HPV) • Dal latino “papilla” (pustola) più il suffisso greco “-oma” (tumore) •

PAPILLOMAVIRUS (HPV) • Dal latino “papilla” (pustola) più il suffisso greco “-oma” (tumore) • Spiccato tropismo per le cellule della cute e delle mucose • Assenza di envelope • DNA a doppio filamento anulare di circa 8000 pb • Circa 100 diversi genotipi

SENSIBILITA’ AD AGENTI CHIMICO-FISICI • • Alte temperature Basse temperature Antimetaboliti (S-fluorouracile) Alfa-TNF e

SENSIBILITA’ AD AGENTI CHIMICO-FISICI • • Alte temperature Basse temperature Antimetaboliti (S-fluorouracile) Alfa-TNF e podofillina

 • Trasmissione sessuale: per mezzo di frammenti di tessuto infetto che penetrano attraverso

• Trasmissione sessuale: per mezzo di frammenti di tessuto infetto che penetrano attraverso microabrasioni • Trasmissione inanimati indiretta: attraverso oggetti • Trasmissione peri-partum: infezione congiuntivale nel neonato da parte di donne portatrici di infezione genitale • Incubazione: da poche settimane a qualche anno

ORGANIZZAZIONE GENOMICA 10 ORF

ORGANIZZAZIONE GENOMICA 10 ORF

Regione L: late (tardive) L 1 espresse solo in cellule infettate in modo 40%

Regione L: late (tardive) L 1 espresse solo in cellule infettate in modo 40% DNA virale produttivo durante l’assemblaggio di virioni maturi. Sotto il controllo di promotori tardivi L 2 E 1 E 2 E 3 espresse sia in cellule infettate in modo non E 4 produttivo che in cellule trasformate. Sotto il E 5 45% DNA virale E 6 controllo di promotori precoci E 7 E 8 Regione E: early (precoci) LCR: long control region 15% DNA virale

ORF LCR FUNZIONI Promotore E 1 Necessario per gli eventi replicativi precoci E 2

ORF LCR FUNZIONI Promotore E 1 Necessario per gli eventi replicativi precoci E 2 Regolazione della trascrizione e replicazione DNA E 3 Funzione sconosciuta E 4 Proteina NS tardiva. Disregola il citoscheletro E 5 Proteina trasformante. Interagisce con i recettori dei fattori di crescita. Es. : PDGF E 6 E 7 Proteina trasformante legata a P 53 Proteina trasformante legata a p. Rb E 8 Regolatore della replicazione e della trascrizione L 1 L 2 Proteina più grande del capside Proteina più piccola del capside

CICLO DI REPLICAZIONE VIRALE • • • Attacco del virus alla superficie della cellula

CICLO DI REPLICAZIONE VIRALE • • • Attacco del virus alla superficie della cellula ospite Penetrazione Esposizione dell’acido nucleico Sintesi dei componenti virali Assemblaggio dei componenti virali neoformati Fuoriuscita del virus dalla cellula infetta dopo lisi cellulare.

tropismo per l’epitelio squamoso pluristratificato, replicandosi solo nelle cellule epiteliali in differenziamento della cute

tropismo per l’epitelio squamoso pluristratificato, replicandosi solo nelle cellule epiteliali in differenziamento della cute e delle mucose fase non produttiva o precoce in cui l’espressione è limitata a geni precoci che inducono la cellula a proliferare ed il genoma è in forma episomale fase produttiva o tardiva con espressione di geni tardivi e formazione di virioni maturi

Tipo di HPV Lesione clinica Potenziale oncogenico 1, 4 Verruche plantari benigno 2, 4,

Tipo di HPV Lesione clinica Potenziale oncogenico 1, 4 Verruche plantari benigno 2, 4, 26, 27 Verruche comuni benigno 3, 10, 21, 28 Verruche piane Raram. maligno 5, 8 Displasie verruciformi in immunocompromessi Spesso maligno 6, 11 Condilomi ano-genitali; basso papillomi laringei 7 Verruche delle mani benigno 9, 12, 14, 15, 17, 1925, 36, 40, 47 Epidermodisplaia verruciforme HPV 17 e 20 evolvono in carcinoma 16, 18, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 34, 40, 42 -44, 5355, 58, 59, 61, 62, 64, 66 -69 Carcinomi della mucosa maligno genitale e laringeo Neoplasie intraepiteliali Alcune danno (genitali e altre mucose) carcinomi 75, 77 Verruche nei trapiantati Spesso carcinomi

 • The normal distribution is that the bottom layer is made of round

• The normal distribution is that the bottom layer is made of round young cells. As the cells mature they rise to the surface and flatten out, so that on the surface the cells are flat.

 • In cervical dysplasia there is a lack of this organized growth process.

• In cervical dysplasia there is a lack of this organized growth process. In mild dysplasia (CIN I) only a few cells are abnormal, while in moderate dysplasia (CIN II) the abnormal cells involve about one-half of the thickness of the surface lining of the cervix.

 • In severe dysplasia or carcinoma-in-situ (CIN III) the entire thickness of cells

• In severe dysplasia or carcinoma-in-situ (CIN III) the entire thickness of cells is disordered, but the abnormal cells have not yet spread below the surface. Carcinoma-in-situ means "cancer in place". If this condition is not treated, it often will grow into an invasive cervical cancer.

 • In dysplasia and carcinoma-in-situ all of the abnormalities are confined to the

• In dysplasia and carcinoma-in-situ all of the abnormalities are confined to the surface lining (or "skin") of the cervix. In invasive cancer the cells are not only disordered throughout the entire thickness of the lining, but they invade the tissue underlying the surface. Invasive cancer is treated entirely differently than dysplasia.

 • The most important concept is that dysplasia is limited to the "skin"

• The most important concept is that dysplasia is limited to the "skin" of the cervix, and has not invaded into the underlying tissue. • Even "carcinoma-in-situ" is not invasive cancer. • In the past, there was a tendency to treat "carcinoma -in-situ" as a much more serious problem than severe dysplasia, when in fact they are essentially the same.

 • Because of this confusion a new classification system for cervical dysplasia was

• Because of this confusion a new classification system for cervical dysplasia was developed. Remember that "plasia" means "growth. " "Neoplasia" means "new growth. " The surface layer of cells ("skin") is called "epithelium. " Putting this together, a new growth within the epithelium is called "intraepithelial neoplasia. " If we are describing the cervix, then the term used is "cervical intraepithelial neoplasia, " or "CIN. "

The Atypical Pap (ASCUS) • This is the category that drives women crazy! This

The Atypical Pap (ASCUS) • This is the category that drives women crazy! This means some cells that are slightly funny looking, but not abnormal enough to call dysplasia. (ASCUS stands for "atypical cells of undetermined significance. ) This category could also be called "probably normal, but I want to keep a close eye on things. " There is a tremendous variation between labs on how many pap smears come back with this reading, which corresponds to the old "Class 2" classification. Some labs will be very liberal in calling normal variations "atypical, " which causes women to worry needlessly. Other labs have stricter criteria for this classification.

HPV danneggia il DNA cellulare Il danno attiva Geni E 6 ed E 7

HPV danneggia il DNA cellulare Il danno attiva Geni E 6 ed E 7 p 53 Quando p 53 è attivata Arresto del ciclo cellulare Se il danno è riparato, il ciclo riprende Apoptosi Morte cellulare inattivano

Se E 6 ed E 7 riescono ad inattivare l’oncosoppressore p 53, la cellula

Se E 6 ed E 7 riescono ad inattivare l’oncosoppressore p 53, la cellula danneggiata sopravvive e può dare origine a cloni cellulari suscettibili di ulteriori danni del DNA fino alla comparsa di cloni cellulari maligni

HPV • L’ANALISI DELLE MUTAZIONI DELLE REGIONI ALTAMENTE CONSERVATE DEL GENE DELLA p 53,

HPV • L’ANALISI DELLE MUTAZIONI DELLE REGIONI ALTAMENTE CONSERVATE DEL GENE DELLA p 53, IN PRESENZA DI HPV, SPECIE SE HIGH RISK, POTRA’ DARCI INDICAZIONI PIU’ VALIDE RIGUARDO ALL’EVOLUZIONE DELLA PATOLOGIA “DA HPV”?

METODI PER L’IDENTIFICAZIONE DELL’INFEZIONE DA HPV

METODI PER L’IDENTIFICAZIONE DELL’INFEZIONE DA HPV

HPV DIAGNOSI • PCR+HYBR • PCR + REVERSE HYBR PER DIFFERENZIAZIONE DI APPARTENENZA AD

HPV DIAGNOSI • PCR+HYBR • PCR + REVERSE HYBR PER DIFFERENZIAZIONE DI APPARTENENZA AD UNO DEI RISK GRADE • E’ POSSIBILE IMPIEGARE CAMPIONI NON BIOPTICI, QUALI STRISCIO O TAMPONE

BIOLOGIA MOLECOLARE • Estrazione del DNA di HPV da sospensioni cellulari (prelievi con spatola)

BIOLOGIA MOLECOLARE • Estrazione del DNA di HPV da sospensioni cellulari (prelievi con spatola) e/o da materiale bioptico • PCR Qualitativa: reazione di amplificazione specifica per la regione genomica L 1 • Rivelazione mediante elettroforesi su gel di agarosio: controllo positivo è la beta-globina

 • Esame Quantitativo: ibridazione del prodotto di PCR ottenuto con una sonda marcata

• Esame Quantitativo: ibridazione del prodotto di PCR ottenuto con una sonda marcata con biotina; reazione in micropiastra. L’assorbanza della reazione viene letta allo spettrofotometro • Genotipizzazione: consente di tipizzare i ceppi mediante l’uso di sonde biotinilate altamente specifiche per i ceppi che devono essere identificati e che differiscono per pochi nucleotidi

GENOTIPIZZAZIONE Importante per poter discriminare tra HPV ad alto o basso rischio oncongeno e

GENOTIPIZZAZIONE Importante per poter discriminare tra HPV ad alto o basso rischio oncongeno e per poter o meno correlare al virus lo sviluppo della neoplasia Linea di controllo Reverse dot-blot. Nested-PCR della regione L 1, marcatura con biotina, aggiunta del coniugato streptavina-fosfatasi alcalina e rivelazione con i cromogeni NBT/BCIP Specificità del 99, 9% Sensibilità di 50 copie per campione Controllo di colorazione Sonda universale 6 11 34 40 42 43 53 54 61 69 70 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 BASSO/MEDIO RISCHIO ALTO RISCHIO

 • Lo sviluppo del tumore e i primi stadi della sua evoluzione si

• Lo sviluppo del tumore e i primi stadi della sua evoluzione si basano sulla produzione di m. RNA anomalo seguita dalla produzione di proteine oncogeniche nelle cellule della cervice. • Durante questo processo la cellula umana contiene alcune sequenze geniche provenienti da un numero limitato di virus HPV ad alto rischio che sono in grado di produrre queste sequenze di m. RNA anomalo e quindi proteine altamente cancerogene.

SIEROLOGIA Non è ancora un metodo utilizzabile per la ricerca di HPV Impossibilità di

SIEROLOGIA Non è ancora un metodo utilizzabile per la ricerca di HPV Impossibilità di ottenere la replicazione del virus in colture cellulari e quindi di antigeni nativi • Numerosi genotipi diversi di HPV

Studio 1 Risposta anticorpale sierica e locale (cervicale) diretta contro un peptide sintetizzato da

Studio 1 Risposta anticorpale sierica e locale (cervicale) diretta contro un peptide sintetizzato da E 2 di HPV 16 • Scopo: valutare la relazione tra Ig. A e Ig. G sieriche e locali • Metodo: ELISA

Studio 1 Ig. A Ig. G siero secrezioni Controlli (n. 20) 4 (20%) 3

Studio 1 Ig. A Ig. G siero secrezioni Controlli (n. 20) 4 (20%) 3 (15%) Low grade (n. 16) 9 (56%) 7 (43%) 3 (18%) 8 (50%) High grade (n. 21) 15 (71%) 11 (52%) 10 (47%) 9 (42%) Lesioni microinvasive (n. 2) Lesioni vulvari (n. 2) Casi patologici tot. 41 2 2 1 0 0 0 1 0 26 (63. 4%) 20 (48. 8%) 15 (36. 6%) 19 (46. 3%)

Studio 1 Discussione: • Ig. A sieriche si trovano più frequentemente in pazienti con

Studio 1 Discussione: • Ig. A sieriche si trovano più frequentemente in pazienti con lesioni cervicali • Aumento delle Ig. A nei tumori (in misura minore le Ig. G) • Ig. A locali si trovano in concentrazione minore rispetto alle sieriche

Studio 2 Anticorpi contro la proteina maggiore del capside dei virus HPV 16, 18,

Studio 2 Anticorpi contro la proteina maggiore del capside dei virus HPV 16, 18, 58 e 6 b • Scopo: valutare la relazione tra presenza di anticorpi Ig. G contro L 1 con il cancro cervicale • Metodo: ELISA

Studio 2 sieropositivi Diagnosi n. CIN 22 43. 9 4(18%) 5(23%) 3(13%) 5(27%) anti

Studio 2 sieropositivi Diagnosi n. CIN 22 43. 9 4(18%) 5(23%) 3(13%) 5(27%) anti HPV 1618 -58 10(45%) Sane 98 43. 2 2 (2%) 1(1%) 24(24%) 12(12%) età anti HPV 16 anti HPV 18 anti HPV 58 10(10%) anti HPV 6 Cancro 67 53. 5 23(34%) 9(13%) 19(28%) 24(36%) 33(49%) cervic. 102 53. 7 4(4%) 1(1%) 11(11%) 19(19%) 14(14%) Sane Condiloma Sane 38 27. 0 6(5%) 4(11%) 6(16%) 21(55%) 13(34%) 48 25. 4 5(10%) 1(2%) 12(25%) 6(13%)

Studio 2 Discussione: • Trovati anticorpi diretti contro genotipi specifici di HPV • Relazione

Studio 2 Discussione: • Trovati anticorpi diretti contro genotipi specifici di HPV • Relazione tra HPV 16, 18, 58 e neoplasia cervicale intraepiteliale o cancro cervicale • Relazione tra HPV 6 e condiloma acuminato • In pazienti con positività per DNA-HPV, negatività o scarsa positività per gli anticorpi • Presenza di anticorpi diretti contro più genotipi di HPV

EPIDEMIOLOGIA • I più frequenti genotipi nei carcinomi anogenitali sono HPV 16 e 18

EPIDEMIOLOGIA • I più frequenti genotipi nei carcinomi anogenitali sono HPV 16 e 18 (nel 50% dei casi) • HPV si riscontra nell’assoluta maggioranza dei casi di cancro della cervice (HPV 16 nel 50% dei casi seguito da HPV 18, 45, 31, 33) • Nei neonati i genotipi più diffusi sono HPV 16 e 18 • Nei bambini i genotipi più diffusi sono HPV 6 e 11

EPIDEMIOLOGIA • Donne giovani e attive sessualmente hanno una più alta incidenza di infezione

EPIDEMIOLOGIA • Donne giovani e attive sessualmente hanno una più alta incidenza di infezione clinica da HPV con un elevato rischio di progressione verso il carcinoma • Gli uomini più frequentemente hanno infezioni latenti da HPV e più raramente evolvono in carcinoma

E’ OPPORTUNO FARE “SCREENING” BIOMOLECOLARE PER HPV? LA PAZIENTE CHE DOVESSERE POSITIVA PER UN

E’ OPPORTUNO FARE “SCREENING” BIOMOLECOLARE PER HPV? LA PAZIENTE CHE DOVESSERE POSITIVA PER UN HIGH RISK, COME REAGIREBBE?