Avaliao da diversidade microbiana Tcnicas moleculares Independentes de

Avaliação da diversidade microbiana Técnicas moleculares (Independentes de cultivo) Expressões da diversidade

Avaliação da diversidade microbiana (métodos independentes de cultivo) Riqueza Equitabilidade número de grupos presentes abundância relativa de cada grupo • Técnicas que envolvem ácidos nucléicos (RNA ou DNA). • Essas técnicas permitem avaliar diversidade (quem está ali? ) • O potencial metabólico ou atividade quando genes metabólicos ou seus transcritos sejam usados nas sondas (o que fazem? ) • Métodos mais diretos e analíticos (como FAME).

Dogma Central da Biologia Molecular Sequências r. RNA são extremamente importantes em estudos filogenéticos porque são conservadas (evoluiram lentamente) participando na síntese da estrutura dos ribossomos e de proteínas. r. DNA indica os genes que codificam para o RNA ribossômico. A maioria dos genes metabólicos são regulados ao nível da transcrição e podem não ser expressos - potencial metabólico. Se o transcrito do gene é expresso então ele será expresso e seu produto será sintetizado - atividade metabólica.

Características dos ácidos nucléicos • Dois tipos de ácidos: RNA e DNA • DNA é codificado por 4 blocos intercambiáveis denominados bases: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. • RNA tem 5 bases diferentes: Adenina, Guanina, Citosina e Uracila.

Ácido desoxiribonucleico DNA Deoxyribonucleic Acid Pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas

Porque os estudos de diversidade usam o r. DNA? Gene que codifica para r. RNA 16 S Cerca de 1500 pb codificam para a subunidade 16 S da molécula de RNA. Parte destas sequências são conservadas para a maioria dos seres vivos: -contém o passado metabólico do último ancestral comum. Regiões variáveis são usadas na taxonomia - filogenética

r. DNA Estrutura primária (sequência) e secundária (laços e dobraduras) ordenam a estrutura terciária (3 D) dos ribossomos. Mapa de variabilidade de SSU r. DNA bacteriano Vermelho = genes altamente conservados SSU (small subunit) 16 S

Como se replica o DNA? l Abertura da dupla fita via reações químicas simples e reconstituição da outra metade de cada fita por imersão em uma mistura composta pelas quatro bases. l Cada base pode se combinar apenas com uma única base complementar. Portanto, uma base na “fita antiga” (+) define qual base pode ocorrer na “fita nova” (-) (Complementaridade das bases) l Dessa forma, após cada abertura da fita, são coletadas do substrato réplicas completas da fita original, exceto quando ocorrer uma mutação.

Replicação do DNA O crescimento do DNA ocorre na direção de 5' para 3' Vídeo 1 Vídeo 2 As duas fitas de DNA estão em direção opostas (anti-paralelas): - uma das fitas tem a direção exata da sua síntese (5'---3') - enquanto que a outra está invertida (3'---5'). Esta conformação em fitas anti-paralelas leva à necessidade de mecanismos especiais para a replicação do DNA.

Reação de amplificação do DNA – PCR (amplificação gênica) l O objetivo é fazer um número elevado de cópias de um gene ou sequência. Células são separadas e lisadas DNA dupla fita é separado em fita única. l Iniciadores (primers) são adicionados (pequenos fragmentos de DNA, 2 -30 nucleotídios) Primers são segmentos complementares aqueles que flanqueiam a sequência alvo Apenas os segmentos DNA alvo entre os primers serão replicados l Cada ciclo térmico de PCR consiste de 3 etapas: – Desnaturação do DNA alvo (separação das fitas): 94 °C – Anelamento por abaixamento da temperatura: 55 °C – Extensão quando primers iniciam a síntese de DNA com uma DNA polimerase: 72 °C l Cada ciclo resulta no dobro das sequências alvo (dura cerca de 60 -90 seg). Geralmente usam-se 30 ciclos.

Taq polimerase lÉ uma enzima termoestável isolada da bactéria Thermus aquaticus, que habita em regiões hidrotermais. l "Taq polimerase" é uma abreviatura de Thermus Aquaticus Polimerase. lÉ geralmente usada no PCR porque é razoavelmente barata e pode suportar as condições da técnica (temperatura de desnaturação).

PCR

PCR

O que fazer com PCR? • Amplificar genes 16 S r. DNA diretamente de amostras ambientais. • Usar primers específicos de certos grupos: detecção específica • Detectar genes funcionais quando sua sequência é conhecida.

Perspectivas - O futuro? Técnicas independentes de cultivo são essenciais, mas são lentas e trabalhosas. Como torná-las mais rápidas para utilizar em análises de comunidades microbianas? Amostras ambientais Processador automático Diversidade microbiana, atividade, potencial metabólico, . . . • Aumentar automação • Uso da robótica • Tecnologia de microarranjos de DNA

FIM