Autoantitestek vizsgl mdszerei HLA tipizls 1 Autoantitestek Termszetes

Autoantitestek vizsgáló módszerei, HLA tipizálás 1

Autoantitestek • Természetes • Patológiás – Ig. M> Ig. G, Ig. A – Ig. G, Ig. A v. Ig. M – Alacsony affinitás – Nagy affinitás – Magas szérum koncentrációt is elérhet – Magas szérum cc. (mg/ml) – • Polireaktív – Specifikusabb – • CD 5 + B 1 sejtek – B 2 sejtek 2

Természetes autoantitestek RA-ban Natural autoantibodies reactive with glycosaminoglycans in rheumatoid arthritis. 3 György B et al. Arthritis Res Ther. 2008; 10(5): R 110.

Természetes autoantitestek által felismert antigének („immunológiai homunculus”) Hősokk fehérjék Enzimek Sejt membrán komponensek Citoplazma komponensei , citoszkeletális elemek Sejtmag komponensek Plazma fehérjék Citokinek Hormonok hsp 65, hsp 70, hsp 90, ubiquitin aldoláz, citokróm- c, SOD, NAPDH β 2 -microglobulin, β 2 spectrin, acetilkolin receptor aktin, miozin, tubulin, mioglobin, myelin bázikus protein DNS, hisztonok albumin, Ig. G, transzferrin IL-1, TNF, IFN thyreoglobin, inzulin 4

Autoantitestek kimutatásának szerepe lehet 1. A betegségek patomechanizmusának jobb megértésében 2. A diagnózisban 3. Prognózisban, rizikócsoportok megjelölésében 4. A betegség aktivitásának megítélésében 5. Terápia eredményességének megítélésében 6. Több kórkép együttes előfordulásának (overlap) megítélésében 5

Autoimmun betegségek Szisztémás SLE RA Scleroderma Sjögren szindróma Dermato/polymyositis Kevert kötőszöveti betegség Szerv specifikus Myasthenia gravis Hashimoto thyreoiditis Basedow-kór Coeliakia IDDM Addison-kór Primer biliáris cirrózis Goodpasture-szindróma 6

Az autoimmun betegségek kivizsgálásának menete Feltételezett autoimmun betegség klinikai tünetek alapján SLE szerű tünetek pl. : „pillangószerű” arcpír Pleuritis Nephritis Izületi fájdalmak Szív panaszok Neurológiai tünetek Estére fokozódó Szemszárazság. izomgyengeség, szájszárazság kettőslátás, nyelészavar Anti-SSA illetve anti-SSB ellenes Acetil-kolin antitest + receptor ellenes antitest + Antinukleáris antitest (ANA) Anti-ds. DNS, anti-Smith antitest, kromatin ellenes antitest, anti-C 1 q antitest + SLE Myasthenia gravis Sjögren szindróma Reggel tapasztalt izületi merevség, fájdalom, duzzanat, mozgáskorlátozottság Emelkedett süllyedés, Creaktiv protein, ANA, RF pozitivitás, anticiklikus citrullinált peptid (CCP) ellenes antitest+ 7 Rheumatoid arthritis

Szisztémás lupus erythematosus Immunkomplex betegségek prototípusa Prevalencia nők körében 1: 800 -1: 1000 Utóbbi években az ismert SLE-s betegek száma nőtt világszerte Horváth-L: Clin Exp Rheumatol 2001, 667 8

Szisztémás lupus erythematosus Immunkomplex betegségek prototípusa Számos különböző autoantitest Színes klinikai kép Pl: vese, kp. Idegrendszer, bőr, ízület, hematológiai érintettség, Raynaud sz. Autoantitestek: Anti DNS (kettős szálú DNS) Rheumatoid faktor (RF) Vvt elleni Thrombocita elleni Beta 2 glikoprotein I elleni Anti C 1 q Gyakori a cryoglobulinaemia: azaz olyan általában immunglobulinokból álló komplexek, melyek alacsony hőmérsékleten kicsapódnak a szérumból 9

Ideális laboratóriumi aktivációs marker a betegség aktivitásának megítélésére Anti-DNS AAT és komplement szint együttes változása: Prognosztikus faktor Terápia hatékonyságának követésére alkalmas kezelés Prognózis! C 3, C 4, CH 50 anti-ds. DNS rosszabbodás javulás 10

Autoantitestek kimutatására használt főbb módszerek SLE-ben • Screening tesztek: – Direkt immunfluoreszcencia a betegből vett szövetmintán – Indirekt immunfluoreszcencia: humán Hep 2 sejttenyészeten pl. antinukleáris antitest (ANA) pozitivitás meghatározására (az autoantitest specifikus mintázatot ad a sejten belül (nukleáris, nukleoláris, centromer, citoplazmatikus, mitokondriális stb mintázat) • Antigén specifikus vizsgálatok: A screening teszt eredménye és a klinikai kép alapján antigén specifikus ELISA, Western blot, vagy radiális immundiffúzió módszerével. § Cryoglobulinok kimutatása 11

Indirekt immunfluoreszcencia szerepe a diagnózisban (Hep 2 sejtekben) Homogén magfestődés Pl. Anti- ds. DNS vagy anti-hiszton Pl: SLE Foltos magfestődés Anti- RNP(nukleáris riboprotein) pl. SLE, Sjögren, vagy normál is! Perifériás „Rimmed „ magfestődés Pl. anti-hiszton Pl. SLE Nukleoláris magfestődés Pl. anti-Topoizomeráz I Pl. Scleroderma 12

Milyen módszerekkel lehet az egyes autoantitesteket kimutatni? 13

ELISA elve: minden antigén specifikus AAT mérése külön kit-ben Minták Menete: 1. Antigénnel fedett ELISA lemez 2. 2. Blokkolás 3. Szérum 100 x hígításban 4. Mosás Standard 5. anti-humán Ig. G / Ig. M- HRP 6. Mosás 7. Színreakció mérése 14

Western-blot Az anti-nukleáris antitest egy összefoglaló név, amennyiben az ANA pozitív specifikálni kell, hogy melyik antitest 15

Radiális immundiffúzió (Mancini) 16

Cryoglobulin kimutatása 1. Keringö immunoglobulin, mely 37 fok alatti hömérsékleten precipitálódik, felmelegítve ismét feloldódik 2. Autoimmunbetegségeken kívül malignus haematológiai betegségekben illetve fertözésekben pl. hepatitis C is jelen lehet. Alcsoportjai: I. monoclonalis Ig. G, II polyclonalis Ig. G és monoclonalis Ig. M, III polyclonalis Ig. M rheumafaktor 3. Meghatározás régen: 37 °C-on serumot szeparáljuk, majd 4 °C 2– 7 napig tartjuk, ha precipitátum képzödik, 4 °C-on centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk és fiziológiás só oldattal pótoljuk. Ha 37 °C-on a precipitátum feloldódik, cryoglobulin volt Ma: immunelektroforézis vagy immunfixáció, mellyel a cryoglobulin alosztályát is meg lehet határozni 17

Rheumatoid faktor (RF) SLE: a betegek 30%-a szeropozitív, sz autoimmun betegségek közül rheumatoid arthritisben fordul elő leggyakrabban, a betegek 80%-ában 18

Reumatoid faktor kimutatása I. 1. Latex agglutinációs teszt Latex gyöngy + beteg szérumában RF Agglutináció 19

Reumatoid faktor kimutatása II. 2. Nephelometria 20

Az autoantitestek prediktív ereje SLE-ben 1. Bizonyos antinukleáris és anti-Ro (SSA) antitestek akár 10 évvel az első tünetek előtt 2. Anti-natív vagy ds. DNA antitestek: átlag 2. 5 évvel a tünetek előtt, a betegek 55%-ában 3. Anti-ribonukleoprotein és anti-Smith (röviden anti-Sm): néhány hónappal a tünetek előtt Prognózis! The Lancet 2004; 363: 1544 -46. 21

Rheumatoid arthritis Felnőtt lakosság körében 1: 100 prevalencia Az izület destrukciójával járó autoimmun betegség Szinoviális membrán gyulladása Autoantitestek: ANA, anticiklikus citrullinált peptid, rheumatoid faktor (RF) 22

Citrullináció Nincs citrullin t. RNS, polipeptidekben arginin alakulhat citrullinná Peptidilarginin deimináz (PAD) enzimek segítségével Citrullinálódhat pl: fibrin, vimentin, enoláz stb. 23

Anti- ciklikus citrullinált peptid (anti-CCP) v. Az anti-CCP kimutatása különösen korai RA-ban hasznos: v. Diagnosztikus és prognosztikus faktor v. A betegség során többnyire szintje nem változik v. Nem korrelál a betegség aktivitásával 24

Szervspecifikus autoimmun betegségek Basedow- kór TSH receptor elleni AT Pemphigus desmoglein elleni AT Myasthenia gravis: ACh receptor , Mu. SK, ryanodin receptor, titin AT 25

Radio-receptor immunoassay (RRA) Pl. anti-ACh. R AAT, anti-Mu. SK AATv. anti-TSH AATkimutatása (pmol vagy annál kevesebb) Gamma-számláló Az immunkomplexek centrifugálva a cső aljára kerülnek, ezt mérjük 26

HLA tipizálás 27

MHC I minden magvas sejt felszínén expresszálódik MHC I fiziológiás funkció: az APC felszínén „mutat be” endogén antigént CD 8 T sejteknek (beta 2 mikroglobulinnal együtt) gyulladás során expressziója fokozódik (pl. interferonok hatására) 28

MHC II antigén prezentáló sejtek felszínén expresszálódik MHC II fiziológiás funkció: az APC felszínén „mutat be” extracelluláris antigént Pl. interferonok hatására nő az expressziója 29

Öröklődés • Poligénes • Polimorf • Kodomináns 30

HLA gének terméke kodominánsan expresszálódik, haplotípusok öröklődnek HLA-DP HLA-DQ HLA-DR HLA-B HLA-C HLA-A Anyai 6 -os kromoszóma MHC II MHC I β 2 mikroglobulin 15 -öskromoszóma HLA-DP HLA-DQ HLA-DR HLA-B HLA-C HLA-A Apai 6 -os kromoszóma 31

HLA rendszer nomenklatúrája Régi nomenklatúra: szerológia alapú –HLA után egy vagy több betű a lókusz megjelölésére pl. HLA-B, HLA-DR. Allél megjelölés még egy szám pl. HLA-B 27, HLA-B 7. 2 évente megújuló, nevezéktan, mely genetikai vizsgáló módszerekre épülve sokkal precízebb megjelölést tesz lehetővé: az adott HLA lókuszon az adott allél: HLA+ betű+*+4 jegyű szám HLA-B*0801 32

A HLA tipizálás felhasználása • HLA polimorfizmus variánsok (allotípusok) meghatározása. • Transzplantáció esetén donor-recipiens hisztokompatibilitási viszonyainak egyeztetése. • Hisztokompatibilitási antigénekkel szembeni szenzitizáció fokának nyomon követése. • Autoimmun betegségekre predisponáló haplotípusok kimutatása. 33

HLA tipizálás 1. – Szerológiai módszerek • Mikrocitotoxicitási teszt (Terasaki) tipizáló savók + lymphocyták • Panel reaktív antitest (HLA szenzitizáció fokának meghatározása) • Keresztreakció (donor sejtjei + recipiens savó) 34

HLA tipizálás Mikrocitotoxicitási teszt (Terasaki) 35

HLA tipizálás Kevert limfocita kultúra (MLC) Csak II. osztályú antigének kimutatására Transzplantáció előtt negatívnak kell lennie a donor és HTC: human T cell recipiens T-sejtjeinek vizsgálata során! 36

HLA tipizálás Molekuláris biológiai módszerek • Restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) • Szekvencia specifikus oligonukleotid szonda (PCR-SSOP) • Szekvencia specifikus primerek alkalmazása PCR vizsgálathoz • Szekvencia alapú tipizálás (SBT)-PCR majd szekvenálás lsd. jövő félév Genetika gyakorlatok 37

Szövet és szerv transzplantáció Vese transzplantáció esetén: mind HLAI, mind HLA II antigének fontosak, az utóbbiból HLA-DR antigén elsőrendű szerep Csontvelő transzplantáció: vfő hisztokompatibilitási antigének egyezése a legfontosabb 1. kérdés: Csontvelő transzplantáció esetén a vércsoportantigének egy része is fontos , de a fő vércsoport különbség ebben az esetben nem akadály. MIÉRT? 2. kérdés: Gyakran az ideális donor a HLA azonos testvér. Miért lehet, hogy a testvér sokszor jó donor lehet? 38

HLA-rendszer és a betegségek kapcsolatának rendszere Klinikai állapot Laboratóriumi teszt Megjegyzés Bechterew-kór HLA-B 27 A betegek közel 98%-ban jelen van, a betegségmentes kaukázusi populáció 7%-ában is. Narcolepsia HLADR 2 (HLA-DQB 1*0602) Közel az összes betegben, normál kaukázusiak 25%-ában is. Hiánya a betegséget valószínű kizárja IDDM HLA-DQ 2 Szoros asszociáció kb 80% Rheumatoid arthritis HLA-DRB 1 HLA-DR 4 70%-ban betegekbenprognosztikus Apasági vizsgálatok HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ, -DP, C 4, -C 2 Polimorfizmus vizsgálatokkal kiegészítve Erdei Anna: Immunológiai módszerek 39

Súlyos Graft-versus host betegség kialakulásának valószínűsége különböző számú HLA mismatch-ek esetén vese transzplantációt követően Petersdorf EW. Et al Curr. Opinion Immun 40 (1999) 11: 121

Bechterew kór klinikai és radiológiai kép 41

Leggyakoribb panaszok, labor leletek Gyulladásos derékfájdalom Többnyire 40 év alatt fokozatosan kezdődő Reggel fokozott Gyakran nyugalomban fokozott Fizikai aktivitás csökkenti Süllyedés, CRP, RF negatív Autoantitest termelés nem jellemző! 42

A betegség progressziója 43

Eset 1. -20 éves férfi, korábban betegsége nem volt -ügyeletbe jön, hirtelen kialakult jo. térdfájdalom, ami mozgatásra fokozódik, a térde duzzadt -trauma nem történt -labor: magas süllyedés, serum RF, anti-CCP norm. -folyadékot a térdéből leszívják, NSAID-ot kap -1 év mulva jobb szem iritis miatt jelentkezik. Elpanaszolja, hogy bár már a térde nem fáj, erős derékfájdalma szokott lenni, gerince merev -HLAB 27 pozitív Mi lehet a diagnózisa? 44

Eset 2. 27 éves nő keresi fel a nőgyógyászati szakrendelést: vgraviditás 4. hónap, spontán abortusz vízületei fájnak, szájában fekélyek alakultak ki vmindkét oldalon lábszárközépig ujjbenyomatot tartó ödéma varcon pillangóalakú bőrpír Labor: anti ds DNS: emelkedett RF: emelkedett anti-cardiolipin AT emelkedett Diagnózis? 45

Eset 3 35 éves nő keresi fel a reumatológiai ambulanciát: v fő panasza: kezek, lábak, vállak hónapok óta tartó fájdalma v MCP, PIP sor és MTP ízületek érzékenyek, duzzadtak v Labor: We: 110; CRP: 40; anti- CCP: 1200; RF: 580 v Kéz és láb RTG: foltos osteoporosis, erosiok Diagnózis? 46

Immunológiai vizsgálat kérőlap 47